第三节基因工程中酶.ppt

第三节基因工程中的酶学 重组DNA技术中常用的工具酶 一、限制性内切酶概念的提出 为什么生物体产生的限制酶，不会损失自身的DNA呢？？？ R/M体系： 寄主是由两种酶活性配合完成的 一种是修饰的甲基转移酶 另一种是核酸内切限制酶 两条链上的断裂位置是交错地，但又是围绕着一个对称结构中心，这样形成的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片段 同位酶 同位酶是具有相同的识别序列，但酶切位点不同的酶 如Sma I和Xma I的识别序列为 5’-CCCGGG-3’,但酶切位点不同。 Sma I 5’-C↓CCGGG-3’, Xma I 5’-CCC↓GGG-3’, 同裂酶（Isoschizomers） 有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶子序列，这类酶称为同裂酶。同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端 Example: 限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一对同裂酶 (CCGG) ， 同尾酶（Isocaudamer） 这一类的限制酶来源各异，识别的靶序列也不相同，但产生相同的粘性末端。由同尾酶产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用彼此连接起来的 BamHⅠ G GATC C BclⅠ T GATC A C CTAG G A CTAG T DNA连接酶 在一条DNA链的3′末端具有一个游离的羟基（-OH），和在另一条DNA链的5′-末端具有一个磷酸基团（-P）的情况下，能够催化在两条DNA链之间形成的磷酸二酯键 大肠杆菌DNA聚合酶 I 的基本用途 其用途是： 除去 DNA 片段的 5 - 磷酸，以防止自身环化。 该酶的用途是：① 为化学测序法标记 DNA 的 5 末端； 小结 1.限制性内切酶：切割 2.DNA连接酶：主要是连接DNA片段之间的磷酸二酯键，起连接作用，在基因工程中起作用。 3.DNA聚合酶：主要是连接DNA片段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，在DNA复制中起作用。　　 （1）必须是两条双链DNA或DNA-RNA。 （2）DNA3’端有游离的-OH， 5’端有一个磷酸基团（P）。 （3）需要能量 动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+ 2. 连接条件 3.DNA连接酶的基本性质 DNA连接酶的基本性质 连接酶反应的最佳温度是37?C。 三、连接反应的温度 1. 最佳温度 但在37℃下粘性末端的结合很不稳定。 2. 实用温度 所以一般采用 4~16 ?C。 第三 DNA聚合酶 一、基因工程中常用的DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 2. Klenow fragment 3. T7 DNA聚合酶 4. T4 DNA聚合酶 5. 修饰过的T7 DNA聚合酶 6. 逆转录酶 二、DNA聚合酶在基因工程中的用途 1. 大肠杆菌DNA聚合酶 I （1）大肠杆菌DNA聚合酶I 的性质 ①一条单链多肽。 ②5’?3’外切酶活性位于N端。 ③3‘→5‘的核酸外切酶活性 ④ 5‘→3‘的DNA聚合酶活性 5‘→3‘的DNA聚合酶活性 2. Klenow fragment 用枯草杆菌蛋白酶处理大肠杆菌DNA聚合酶 I可以切掉N端的5’?3’外切酶活性部分。就成为Klenow fragment。具有5’?3’聚合酶活性和3’?5’外切酶活性。（失去了5’?3’外切酶活性）。 （1）Klenow fragment的性质 ① 3’端补平 补平限制性内切酶切后形成的3’隐蔽端。 （2）主要用途 3’ 3’ ② DNA 3’末端标记 在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP。 3. 逆转录酶 最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus, AMV）： 依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。 来源 RNA肿瘤病毒。 逆转录酶的用途 以oligo dT为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合）。 ① 第四、碱性磷酸酶 1. 碱性磷酸酶种类 从大肠杆菌中分离出来。 Bacterial alkaline phosphatase，BAP （1）细菌性碱性磷酸酶 （2）小牛肠碱性磷酸酶 Calf intestinal alkaline phosphatase，CIP 从小牛肠中纯化出来。 具有抗热性。 SDS中加热68oC可完全失活。 第五、T4多核苷酸激酶 1. 来源 从T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。 2. 功能 催化?磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5’-OH端。 不论5’-OH端突出与否。 * * 关键词： 了解各种酶在基因工程中的作用