HPLC法测定丹参超临界萃取物中丹参酮ⅡA含量.docVIP

HPLC法测定丹参超临界萃取物中丹参酮ⅡA含量 　【关键词】 ,高效液相色谱法 ［摘 要］ 目的：建立超临界流体萃取(supercritical fluid extraction，简称SFE)技术和高效液相色谱(HPLC)技术联用测定丹参中主要成分丹参酮ⅡA含量的方法。方法：探讨改性剂、温度、压力等条件对回收率的影响，确定SFECＯ2萃取丹参中丹参酮ⅡA的最佳条件；并采用HPLC法对萃取成分中丹参酮ⅡA进行定量分析，确定最佳的色谱分析条件。结果：用超临界流体萃取丹参的最佳萃取条件为：萃取压力30 MPa，萃取温度45 ℃；分离釜I压力16 MPa，温度40 ℃；分离釜Ⅱ压力8 MPa，温度33 ℃；CO2流量为3．3 L/h：萃取时间6 h；改性剂用丙酮，流速为0．3 L/h。最佳色谱条件：ODSC18色谱柱(4．6 mm×250 mm)，流动相为甲醇水(V∶V=75∶25)，紫外检测波长270 nm，流速1．0 ml/min。丹参酮ⅡA浓度在23．36 μg/ml～116．80 μg/ml范围内，峰面积与进样量线性关系良好，平均回收率为99．12％，RSD=1．99％。结论：用SFE HPLC联用提取测定丹参中主要成分丹参酮ⅡA回收率高、方法快速简便、结果准确、灵敏度高、重现性好。 　　［关键词］ 高效液相色谱法；超临界流体萃取；丹参；丹参酮ⅡA 　　丹参是我国传统使用的中药，具有祛瘀止痛、活血通经、清新除烦之功效，能抑制血小板黏附、聚集和释放，扩张血管和改善微循环，近年来还证实具有抗氧化和钙拮抗作用［1］。药理研究表明，丹参主要有效成分包括丹参素、丹参酮、原儿茶醛。其主要化学成分之一丹参酮ⅡA有明显的抗炎作用，并广泛应用于冠心病的治疗［2］，近年来还被应用于肿瘤的治疗［3］。《中华人民共和国药典》(2000年版)以丹参酮ⅡA作为标定丹参的主要成分［4］。超临界CO2流体萃取(简称SFECO2萃取)技术是近20年来发展起来的在分离领域出现的一种新技术［5］。它与常规溶剂萃取的区别是选用一种称为超临界流体(SF)的物质代替有机溶剂作为萃取剂。它是利用在临界点附近，体系温度和压力的微小变化可导致物质溶解度发生几个数量级的突变的特性实现物质的分离。该法具有无毒、快速、廉价、低温操作等优点。本实验采用HPLC法对丹参超临界萃取物中丹参酮ⅡA的含量进行定量测定。 　　1 材料与方法 　　1．1 实验仪器 SFE-1型超临界萃取器(大连八达空间科学应用技术研究所)，本系统由萃取釜、分离釜Ⅰ、分离釜Ⅱ、制冷机、高压泵和净化器6部分组成。 日本岛津LC-10AD型高效液相色谱仪，77251进样阀(Rheodyne USA，附20 μl定量环管)，SPD-10A紫外可变波长检测器(JAPAN)，ODS-C18色谱柱(4．6 mm×250 mm)；江申色谱工作站；V-560紫外分光光度计(JASCO日本分光株式会社)；TG328A型分析天平(上海天平仪器厂)，SK-1快速混匀器；CQ250超声波清洗器(上海超声波仪器厂)，真空泵(天津)、针筒式油膜过滤器(0．45 μm)(大连伊利特科学仪器有限公司)。 　　1．2 药材与试剂 丹参(安徽毫州，批号021112)；丹参酮ⅡA标准品(中国药品生物制品鉴定所)；CO2(大连化学物理研究所)；甲醇为色谱纯(天津市科密欧化学试剂开发中心)；丙酮为分析纯；水为去离子水。 　　1．3 超临界流体萃取过程 将丹参的根茎切粒后投入萃取釜中，按设定的萃取路线：CO2钢瓶―冷冻系统―高压泵―萃取釜―分离釜I―分离釜Ⅱ―净化器―CO2贮罐(循环用)。分别对萃取釜、分离釜I、分离釜Ⅱ进行加热，当温度分别达到45℃、40℃、33℃ 时，通过高压泵对萃取釜、两个分离釜进行加压，当压力分别达到30 MPa、16 MPa、8 MPa时，开始循环萃取，并保持恒温恒压，CO2流速3．3 L/h。萃取分离时每隔一定时间放出萃取产物。图1：SFECO2流程示意图（略） 　　1．4 色谱条件 ODSC18柱(4．6 mm×250 mm)，流动相为甲醇∶水(V∶V=75∶25)，紫外检测波长270 nm，流速1．0 ml/min，温度为室温，进样量为20 μl。 　　1．5 标准溶液的配制 丹参酮ⅡA标准品至干燥器中干燥24 h，精密称取14．64 mg，置25 ml棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，再配制成每毫升含23．36 μg，46．72 μg，70．08 μg，93．44 μg，116．80 μg，140．16 μg的标准品甲醇溶液，放入冰箱冷藏室保存。 　　1．6 标准曲线的制备 在上述色谱条件下进样测定，记录丹参酮ⅡA的色谱图，见图1（略）。每个实验点重复进样3次，分别记录峰面积，计算峰面积平均值(Y)，结果见表1。以丹参酮