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HLA基因分型方法探究进展 　【关键词】 分型 人类白细胞抗原（liuman Leukocyte Antigen，HLA）是位于人类第6号染色体短臂上一组紧密连锁的基因群，是目前人体中最具有多态性的遗传系统，由三类基因组成，即Ⅰ类基因、Ⅱ类基因和Ⅲ类基因，可以作为一个遗传单位或单倍型（haplotype）而遗传给下一代，属共显性等位基因［1］。人类白细胞抗原（HLA） 系统是机体免疫系统的重要组成部分，在机体的抗原呈递和免疫应答中发挥重要作用。HLA基因与人类多种疾病的发生、发展和预后密切相关。 人类的I类基因位点命名为HLA－A、HLA－B、HLA-C，分布于所有的组织细胞上，为细胞膜上的移植抗原，是引起移植后排斥反应发生的主要抗原。Ⅱ类基因则命名为HLA－D，HLA－D又分为HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP等亚区，主要分布于免疫细胞上，它们可以作为免疫细胞间识别标记而诱发免疫应答和调节免疫细胞间的相互作用，在免疫应答反应中发挥重要作用。Ⅲ类基因区位于HLA-I、Ⅱ类基因区之间，由一些与补体和某些炎症因子编码相关的基因组成。这些基因在机体的免疫及机体对外界环境的适应性方面均有重要作用。准确的HLA抗原分型技术无疑在基础研究和临床应用上都有很重要的意义,本文就近年来HLA基因分型研究进展加以综述。 Terasaki等（1964年）最早创造了简便易行、敏感可靠、重复性好的微量淋巴细胞毒试验，为HLA的血清学研究开启了大门。随后随着分子生物学技术的不断发展，HLA分型方法分别经历血清学分型、细胞学分型和DNA分型三个阶段。 　　1 血清学分型法 经典的HLA血清学分型方法是使用微量淋巴细胞毒试验。但由于HLA等位基因序列的高度同源性，使血清学出现较多较强的交叉反应，获得特异性高的抗体受到限制，影响了分型结果的正确性。Mytilineos等［2］用DNA-RFLP和血清学方法对 HLA－DR分型进行比较，结果表明血清学方法HLA-DR分型错误率竟在25%以上，相比而言，对于HLA-I类抗原，血清学分型结果可信度更大。但与DNA分型相比，即使用于HLA-I类抗原，血清学分型仍然会出现错判或漏检，这是因为缺乏对抗原反应的特异性抗血清或目的抗原被同一交叉反应组内另一抗原掩盖，尤其是用于B位点的检测。1991年，第11届国际组织相容性专题研讨会对HLA血清学研究进行了总结，HLA血清学研究大体告一段落。 　　 2 细胞学分型法 可用于测定HLA-Dw和HLA-DPw抗原的特异性。由于分型所需的细胞来源困难及细胞表面抗原的复杂性，且方法繁琐，因此细胞学方法不再作为常规分型，已逐渐被淘汰。此外，用细胞学方法所检出的特异性均加上“w”，以此与补体成分相区别。 　　 3 分子生物学分型法 80年代后期，随着PCR技术的不断进步，分子生物学分型方法被人们应用于HLA研究领域，最常见的方法有：SSP,SS0,SBT等。 3.1 多聚酶链反应-限制性片段长度多态性（polymerase chainreaction-restriction fragmentlength polymorphism，PCR-RFLP）［3］ RFLP分析是最早建立的研究HLA多态性的DNA分型技术。不同等位基因由于其核苷酸序列不同，所以就有不同的酶切位点和数目。酶切后产生不同长度、不同数目的DNA片段，经电泳、染色、紫外照射成像后即可确定HLA基因型别。若DNA片段先扩增，再酶切即为结合PCR技术的PCR-RFLP，提高了敏感度与准确性。Maeda等［4］最早应用以PCR为基础的PCR-RFLP技术对HLA-Ⅰ类和Ⅱ类分子进行了成功检测。但该类方法大多存在着操作复杂、容易产生差错等弊病。 3.2 多聚酶链反应-序列特异性引物（polymerase chain reaction-sequence specific primer，PCR-SSP）［5］ 根据HLA核苷酸碱基序列的多态性和已知的DNA序列，设计一系列等位基因型别特异性序列引物，通过特定的PCR反应体系扩增各等位基因的型别特异性DNA片段，产生相对应的特异性扩增产物条带，然后通过凝胶电泳检测PCR产物。根据是否得到PCR产物以及产物的片段大小来分型。其特点是操作简单，对实验设备要求不高，扩增后处理过程十分简单。但是PCR-SSP技术也存在着不足，该方法需要设计大量的引物，对引物的设计和PCR条件要求很严，且容易造成污染，产生假阳性，而且对样本DNA的用量也较大，给临床应用带来了不便。 3.3 多聚酶链反应-序列特异性寡核苷酸反应（polymerase chain reac-tion-sequence specific oligonucleotide probingPCRSSO或PCR-SSOP