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Magainin-Aurein杂合肽基因合成及克隆 　 作者：栗学清　邓秀丽　曹黎刚 【摘要】 目的:构建抗菌肽Magainin-Aurein杂合肽基因，并将M-A杂合肽基因克隆到载体pUC18上。方法:根据已报道的抗菌肽Magainin-2和Aurein1.2基因的氨基酸序列，推导出其cDNA序列，采用基因片段合成结合PCR扩增的策略，分别获得大量完整的Magainin-2和Aurein1.2基因片段。将两者连接为杂合基因并克隆到载体pUC18上。结果:构建了M-A杂合肽基因重组质粒，经PCR扩增、酶切和DNA测序分析表明，杂合肽基因的DNA序列及阅读框完全正确。结论:pUC18-M-A重组质粒构建成功，为进一步亚克隆到表达载体并进行高效表达打下基础，并为其他抗菌肽杂合肽的制备提供了参考。 【关键词】 Magainin-2;Aurein1.2;杂合肽基因;克隆 　本实验采用构建杂合肽基因的策略，将抗菌活性强的Magainin-2基因和抗癌谱广的Aurein1.2基因串联起来，并克隆到载体中，以期为进一步亚克隆到表达载体并表达出具有高活性的既抗菌又抗癌的广谱抗菌肽打下基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　大肠杆菌Top10为长治医学院生物化学教研室保存，质粒pUC18、T4DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、dNTP、碱性磷酸酶均购自华美，T4多核苷酸激酶、UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司，限制酶、X-gal、DNA Marker购自TaKaRa公司，IPTG购自Promega，其他试剂均为国产分析纯。基因和引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 　　 　　1.2 方法 　　1.2.1 基因的设计与合成:根据Genbank中Mag-ainin-2和Aurein1.2的氨基酸序列，选择大肠杆菌偏爱的密码子反推出其全长cDNA序列。人工设计合成4个基因片段，分别称为M1、M2、A1和A2。并在Magainin-2基因5，端引入EcoRⅠ酶切位点和羟胺切割位点，在Aurein1.2基因中引入SalⅠ酶切位点。①基因片段M1:5’CG-GAATTCAACGGCATTGGCAAATTTCTGCATAGCG CGAAAAAATTTGGC3’。②基因片段M2:5’GCT-GTTCATAATTTCGCCCACAAACGCTTTGCCAAATT TTTTCGCGCTATC3’。③基因片段A1:5’GTGCT-GCCGGGCCTGTTTGATATTATTAAAAAAATTGCG 3’。④基因片段A2:5’CCGTCGACT-CAAAAGCTTTCCGCAATTTTTTTAATAATATC3’。 　　 　　1.2.2 基因片断的磷酸化、连接:将基因片断M2、A1分别用T4多核苷酸激酶（T4PNK）按照产品说明书进行磷酸化。然后将分别含有20、21对碱基互补序列的基因片段M1和M2、A1和A2，互为底物和引物直接进行PCR扩增，合成完整的Magain-in-2和Aurein1.2基因。PCR反应过程:在20μL的PCR反应体系中，管1加入10×Buffer2μL，4×dNTP（25mmol/L）1μL，片段M1、M2（10μmol/L）各1μL，Taq DNA聚合酶1U;管2加入10×Buffer2μL，4×dNTP（25mmol/L）1μL，片段A1、A2（10μmol/L）各1μL，Taq DNA聚合酶1U;PCR反应条件:94℃预变性5min，94℃30s，55℃30s，72℃30s，共30个循环，72℃延伸5min。回收PCR产物，在T4DNA连接酶及ATP的作用下将Maga-inin-2和Aurein1.2基因16℃连接12h。 　　1.2.3 连接产物的回收:将连接液在1.5%的低熔点琼脂糖凝胶中电泳，切下大小约为140bp的连接片段，按UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒说明书进行回收。 　　1.2.4 重组质粒的构建、转化与筛选:质粒 pUC18、连接片段的EcoRⅠ、SalⅠ限制性消化、质粒的去磷酸化以及与杂合肽基因片段的连接、转化，以上过程均参照《分子克隆实验指南》 ［8］ 进行。转化的大肠杆菌Top10菌液铺制在含IPTG和X-gal的Amp抗性的LB琼脂平板上37℃培养过夜。利用α-互补原理，通过蓝白斑筛选出重组质粒。 1.2.5 重组质粒的鉴定:采用引物P1和P2（根据载体上序列设计的引物P1:5’TTGTAAAACGACG-GC3’，P2:5’TGCAGGTCGACTCAG3’）进行PCR扩增初步鉴定重组子，PCR扩增条件:94℃预变性5min，94℃30s，50℃30s，72℃30s，共30个循环，72℃延伸7min。重组质粒经E