β细辛醚对缺血-再灌注损伤心肌细胞保护作用.docVIP

β细辛醚对缺血-再灌注损伤心肌细胞保护作用 　 作者：吴启端 王绮雯 陈奕芝 吴雪茹 何玉萍 【摘要】 　　[目的] 观察石菖蒲有效成分β细辛醚对缺血-再灌注损伤(MIRI)心肌细胞的保护作用。[方法]培养原代乳鼠心肌细胞，采用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)复制心肌细胞MIRI模型，以四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定细胞存活率，紫外分光光度法测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)的含量，利用流式细胞术(FCM)检测线粒体膜电位(MMP)平均荧光强度。[结果]β细辛醚能显著提高MIRI模型细胞存活率，降低培养液中LDH、CK的含量，提高MMP值(均Plt;0.05)。[结论]β细辛醚对MIRI心肌细胞具有保护作用，其作用机理可能与减轻细胞膜损伤，降低线粒体膜通透性有关。 【关键词】 β 细辛醚/药理学 缺血-再灌注损伤/中药疗法 心肌细胞/病理学 细胞培养 　　石菖蒲是治疗心脑血管病的常用药，前期研究表明石菖蒲挥发油对心脑血管系统有明显的保护作用，β细辛醚是挥发油中含量最高的主要有效成分，具有抗缺氧、抗心肌缺血、改善血液流变性和血小板聚集性、降血脂[1-3] 、扩张冠状动脉[4]等多种药理作用。本研究采用原代培养乳鼠心肌细胞观察β细辛醚对缺血-再灌注损伤(MIRI)心肌细胞的保护作用并探讨其作用机理。现报道如下。 　　1 材料与方法 　　1.1 药品和试剂 β细辛醚由石菖蒲挥发油精制而成〔经气-质联用(GCMS)检测纯度为99.44%)〕，广州中医药大学第一附属医院实验中心提供，临用前用吐温80、甘油助溶配成溶液使用;连二亚硫酸钠(天津市福晨化学试剂厂);2.5g/L胰酶、高糖DMEM粉剂培养基(GIBCO公司);新生牛血清(TBD公司);5溴2脱氧尿苷(Brdu)、二甲基亚砜(DMSO)(Sigma公司);四甲基偶氮唑盐(MTT，广州威佳科技有限公司);罗丹明123(ALEXIS CORPORATION公司);乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。 　　1.2 动物 出生24h以内的SD乳鼠由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：0020686、0020567。 　　1.3 主要仪器 5400型CO2培养箱(美国NAPCO公司);LX50/LX70型倒置显微镜(日本OLYMPUS公司);BIORAD550型酶标仪(日本);6010型紫外/可见分光光度计(惠普上海分析仪器有限公司);ALTRA型流式细胞仪(美国BECKMAN COULTE公司，配套EXPO32采集分析软件)。 　　1.4 乳鼠心肌细胞的分离培养 取出生24h以内的SD乳鼠，体积分数75%酒精消毒后，取出心脏，用预冷磷酸盐缓冲液(PBS)反复清洗3次，剪成3mm3大小的块状，放入小瓶子中，加入2.5g/L胰蛋白酶，4℃放置16h。取出，小心去除胰酶，重新加入2.5g/L胰酶，37℃放置20min，DISEASE MODELS，ANIMAL; MICE 加入含体积分数10%新生牛血清的DMEM培养基终止消化，用吸管轻轻吹打至组织完全散开。100目钢筛过滤细胞悬液，滤液收集于10mL刻度离心管中，离心去上清。细胞接种于培养瓶中，置37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。2h后以差速贴壁分离法纯化细胞，然后按1×106个/mL的浓度接种于培养板中。置37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，每24h更换1次培养液，前3d加入溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)抑制成纤维细胞分裂增生，培养3～5d待实验。 　　1.5 实验分组及MIRI模型制备 实验分为6组：正常对照组心肌细胞不做任何处理，按正常条件培养;MIRI模型组将细胞按照模型制备方法处理;给药组(β细辛醚高、中、低剂量组)心肌细胞再灌注时将”缺血”液换成含β细辛醚(终浓度分别为25、12.5、6.25μg/mL)的培养液作用18h;基质组心肌细胞再灌注时将”缺血”液换成含基质(吐温80、甘油)的培养液作用18h。 　　模型制备[5]:采用PBS+化学缺氧剂(Na2S2O4)复制”缺血”模型。配制终浓度为1mmol/LNa2S2O4的PBS液为”缺血”溶液(临用时配制，避光)。造模时将正常的细胞培养液换成”缺血”液，CO2培养箱中孵育2h，造成细胞”缺血”。再将”缺血”液换成正常培养液孵育18h，造成再灌注损伤，之后立即收集细胞进行相关实验。 　　1.6 细胞形态学观察 用倒置显微镜观察心肌细胞生长及病变情况。 　　1.7 MTT法检测MIRI心肌细胞存活率 心肌细胞悬液接种到96 孔板，每孔100μL，待细胞贴壁后，按1.5方法分组及处理后，每孔加入10μL MTT (5g/L) ，置37℃、体积分数5%CO2培养箱作