基因表达谱芯片技术筛选乙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白基因C1反式.docVIP

基因表达谱芯片技术筛选乙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白基因C1反式 　 作者：蔺淑梅，成军，杨媛，刘敏，张黎颖，郭江 【摘要】 目的 对未知功能基因C1转染人肝母细胞瘤细胞系(HepG2)后的基因表达谱进行分析，探索该基因的表达对肝细胞基因表达谱的影响及其可能的调节功能线索。方法 以分子生物学技术构建C1的真核表达载体pcDNA3.1(-)C1，以表达质粒pcDNA3.1(-)C1转染HepG2细胞，空载体pcDNA3.1(-)为平行对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA，逆转录为cDNA。 应用基因表达谱芯片技术对差异表达的mRNA进行检测和分析。结果 HepG2细胞经转染C1表达质粒后，有26条差异表达基因，其中24条基因表达水平下调，2条基因表达水平上调。这些差异表达的基因与细胞信号转导、凋亡、细胞增生分化及肿瘤的发生密切相关。结论 应用基因表达谱芯片成功筛选了C1转染细胞后差异表达基因，为进一步阐明C1蛋白可能的生物学功能及乙型肝炎病毒核心蛋白的致病机制提供了理论依据。 【关键词】 乙型肝炎病毒；核心蛋白；反式激活基因；基因表达谱芯片 乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)是组成核壳的主要成分，由183个氨基酸残基(aa)组成，分子质量为21-22ku。在HBV的生活周期中，HBcAg、mRNA和DNA聚合酶共同构成核心颗粒，在核心颗粒中完成病毒DNA的合成。HBcAg不仅具有保护病毒mRNA，防止其被RNA酶降解的作用，而且对于HBV前基因组RNA的装配、基因组DNA的合成亦有重要作用，还与病毒成熟、识别包膜蛋白以及病毒向细胞外释放等过程密切相关[12]。在介导免疫应答方面，HBcAg特异性CD4+ T细胞免疫应答是清除HBV的重要反应[3]；另外，B细胞刺突尖部有HBcAg的抗原决定簇，可产生相应的体液免疫反应[4]。我们利用酵母双杂交系统3，以HBcAg作为“诱饵”，对白细胞cDNA文库中与HBcAg相互作用的蛋白进行研究，获得了一种能与HBV核心蛋白结合的新蛋白，将编码该蛋白的基因命名为C1。我们首先应用基因表达谱芯片技术(cDNA microarray)筛选C1表达质粒转染HepG2细胞后的差异表达基因，并进行分析，为今后更加广泛深入地研究新基因C1功能及核心蛋白的反式调节作用打下了基础，并为乙型肝炎发病机制提供新的研究方向。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞由本室保存；细胞培养相关试剂、总RNA提取试剂Trizol及pcDNA3.1(-)真核表达载体均购自Invitrogen公司；FuGENE6 转染试剂购自Roche公司；pcDNA3.1(-) C1由本室构建；表达谱芯片由上海联合基因有限公司提供。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞培养及取材 　　在35mm培养皿中常规培养HepG2细胞，细胞生长至对数期时，分别以脂质体转染试剂FuGENE6将2μg pcDNA3.1(-)C1和空载体pcDNA3.1(-)转染HepG2细胞，48h后收获细胞，每5×106个细胞加入1mLTrizol试剂，立即于液氮中保存。 　　1.2.2 总RNA提取 　　使用Trizol试剂一步法提取pcDNA3.1(-)C1和空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞总RNA(分别标记为实验组和对照组)。样品经分光光度计检测吸光度A值，并行热稳定实验，于-20℃和70℃保温1h后，经琼脂糖凝胶电泳检测28S、18S条带变化。 　　1.2.3 探针标记 　　常规方法逆转录标记cDNA探针并纯化。Cy3dUTP标记对照组细胞mRNA(5μg)，Cy5dUTP标记实验组细胞mRNA(5μg)，乙醇沉淀后溶解在20μL 5×SSC+2g/L SDS杂交液中。 　　1.2.4 芯片制备 　　芯片包含的1152个cDNA由上海联合基因有限公司提供，包括原癌基因、抑癌基因、免疫调节相关基因、细胞凋亡和应激反应蛋白相关基因、信号转导相关基因等。以通用引物进行PCR扩增，PCR产物长度为1000-3000bp。靶基因以0.5mg/L溶解于3×SSC溶液中，用Cartesian公司的Cartesian 7500 点样仪及TeleChem公司的硅烷化玻片进行点样。玻片经水合(2h)、室温干燥(0.5h)、紫外线交联，再分别用2g/L SDS、水及2g/L的硼氢化钠溶液处理10min，晾干备用。 　　1.2.5 预杂交 　　将预杂交液放入95℃水浴锅内变性2min，将待预杂交的芯片放入95℃水浴锅内变性30s，芯片取出后即放入无水乙醇中30s，晾干。将已变性的预杂交液加到芯片的点样区域内，盖上盖玻片，放入杂交箱内42℃预杂交5-6h。 　　1.2.6 杂交及洗涤 　　将探针置于