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对照检测病原体单细胞悬液制作及保存 　 作者：任兴昌,卢晴晴,陈洪勋 【关键词】 病原体;单细胞悬液；染色 　　The Preparation and Preservation of Single Cell Suspension of Pathogenic 　　　Key words：Pathogenic；Single cell suspension;Stain 　　病原体单细胞悬液有广泛的应用前景，尤其在临床实验、病理诊断中更是具有十分重要的作用。由于无论是机器操作还是手工操作均不能保证每张玻片的条件(如时间、剂量、效价程度或其他因素等)相同，到目前为止还没有设立真正意义上的对照的方法，除少数试剂可于片中寻找自身对照外，部分结果阳性、阴性及阳性的度以及结果的准确性较难判定。而单细胞悬液的制作选择各种已知阳性组织、细胞以及病原体标本，制成可以长期保存的含有均匀分散的单细胞悬浮液体对照物质，在进行玻片实验时将相应的对照物质点、涂少许于玻片上，同实验对象一起进行实验，以建立真正的对照，判断的结果准确可靠。为此，我们对与病原体形态检测有关的对照物质的制作与保存做了一些研究探讨。 　　1 材料与方法 　　 　　选择我院临床活检取自外阴及宫颈赘生物，10％甲醛固定的尖锐湿疣病例、白色假丝酵母菌培养物(光滑型1个培养皿、粗糙型2个培养皿)、外周血淋巴细胞培养物、肾小管上皮细胞培养物以及取自肾病变组织的肾结核各1例。均进行细胞分散，常规HE染色(即苏木精伊红染色)/Ziehl—Neelsen抗酸杆菌染色，经显微镜镜检后证明单细胞悬液在临床实验与病理镜检中的可行性。 　　1．1 试剂 由于实验对象的不同，实验所需试剂有所区别。通用试剂1：PBS缓冲溶液;通用试剂2：生理盐水(每整瓶生理盐水+肝素1支)；通用试剂3：10％甲醛溶液;通用试剂4：HE染色剂;通用试剂5：保存液；外周血淋巴细胞培养物所需试剂：红细胞裂解液;外周血淋巴细胞培养物／肾小管上皮细胞培养物所需试剂：70％乙醇溶液;肾结核所需试剂：Ziehl—Neelsen抗酸杆菌染色剂;尖锐湿疣所需试剂：胶原酶Ⅱ。 　　1．2 实验步骤 　　1．2．1 白色假丝酵母菌培养物(光滑型／粗糙型)单细胞悬液的制备 将光滑型与粗糙型白色假丝酵母菌分涂布于冷却的培养基上，室温培养24 h。→分别挑取适量的光滑型与粗糙型白色假丝酵母菌加入含肝素的生理盐水中置于震荡器上混匀后，各加入2滴10％甲醛溶液固定30 min。→3 000 r／min离心10 min后，弃上清。→用生理盐水(含肝素)清洗，3 000 r／min离心10 min，弃上清，重复此步骤2次～3次→加1倍～5倍保存液，震荡混匀，4 ℃冰箱保存。→取混合液1滴于玻片，常规HE染色。→烘干，中性树肢封片，显微镜镜检。 　　1．2.2 肾小管上皮细胞培养物单细胞悬液的制作 将培养物连同液体培养基一起加入50 ml离心管，2 000 r／min离心10 min，去上清。→加入PBS缓冲溶液清洗培养基，2 000 r／min离心10 min，去上清液，重复此步骤2次。→加入适量PBS缓冲溶液，并加入1／10量的70％乙醇溶液进行固定。→2 000 r／min离心10 min，去上清。→加入适量PBS缓冲溶液，2 000 r／min离心10 min，去上清。重复此步骤2次。→加1倍～5倍组织量的保存液，震荡混匀后，4 ℃冰箱保存。→取少许于玻片上，常规HE染色。→烘干，中性树胶封片，显微镜镜检。 　　1．2．3 肾结核(病变组织已固定)单细胞悬液的制作 取50 ml离心管2支，加入已固定的和机械绞碎的富含结核杆菌的组织。→将已固定的肾结核以3 300 r/min离心15 min，去上清。→加入PBS缓冲溶液清洗，3 300 r／min离心15 min，去上清。→重复此步骤2次～3次。→加1倍～5倍保存液，震荡混匀，4 ℃冰箱保存。→取少许于玻片上，ZiehlNeelsen抗酸杆菌染色。→烘干，中性树胶封片，显微镜镜检。 　　1．2．4 10％甲醛固定的尖锐湿疣组织单细胞悬液的制作 取已固定的尖锐湿疣组织，用PBS缓冲溶液漂洗，然后将其切碎成为1 mm2～5 mm2左右的小块，280目筛网过滤。→将过滤后的混合液2 000 r／min，离心10 min，去上清。→加入30倍～50倍组织量的胶原酶Ⅱ，密封。→离心管放入37 ℃恒温箱，每隔30 min振摇一次，消化24 h，→2 000 r／min离心10 min，去上清。→加入PBS缓冲溶液清洗，2 000 r/min离心10 min，去上清。→重复此步骤2次。→加入2．5倍组织量红细胞裂解液，震荡混匀10 min～15 min，进行充分裂解。→2 000 r／min离心10 min，去上清。→加