重组人肝刺激物在原核细胞中表达及纯化.docVIP

重组人肝刺激物在原核细胞中表达及纯化 　　　摘要：利用基因重组技术, 构建成人肝刺激因子(hHSS)和谷胱甘肽转移酶(GST)融合表达载体, 转化大肠杆菌BL-21 (DE3), 以His·Tag亲和层析纯化表达产物, factor Xa切割分离hHSS单体, 并检测其生物学活性。 结果显示, 在pET-42a表达体系中hHSS以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在, gST-hHSS表达量占菌体可溶性蛋白的30%; Factor Xa切割GST与hHSS之间肽腱, 得到33 和15 kD两条蛋白带,经Western杂交证实33 kD条带为GST, 而15 kD条带的分子量与hHSS基因序列推测蛋白结果相符。经His·Tag再次纯化可获得hHSS单体,初步证实重组hHSS具有促进肝癌细胞增殖活性。肝刺激因子(hepatic stimulator substance, HSS)是广泛存在于初断乳动物肝脏或再生肝脏中的一种促肝细胞增殖因子[1～2]。有关HSS的研究虽取得了一定进展[3～7],但由于它在肝细胞中含量极低, 提取和纯化十分困难, 至今仍未获纯品, 故迄今许多实验仍采用部分纯化的HSS。这不仅严重制约了HSS作用机制的深入研究,也影响了其在临床的实际应用。鉴此, 本实验构建了hHSS原核表达载体, 体外表达重组hHSS, 为深入研究HSS的调控机制和临床应用提供了物质基础。 　　1材料和方法 　　1.1 质粒的转化与筛选分别以SalⅠ/EcoRⅠ消化表达载体pET-42a(+)(Novagen)和含hHSS基因的pUC18-hHSS (本室构建)。通过Glassmilk(Bio 101)回收相应片段, 构建pET-42a-hHSS表达质粒, 转化BL-21感受态细菌。以Kanamycin 筛选阳性细菌克隆, 再以PCR方法鉴定转化细菌是否含有hHSS基因,条件为: 94℃ 变性5 min后, 94℃, 50 s; 65℃, 40 s; 72℃, 1 min 40 s; 反应30次循环; 最后72℃延长8 min。扩增产物经琼脂糖电泳确证含有hHSS重组基因的阳性克隆。 　　1.2 GST-hHSS融合蛋白的诱导与表达分别取5个含pET-42a-hHSS转化克隆菌, 接种LB培养液, 以IPTG (1 mmol/L)诱导hHSS基因表达。4 h后,以10000 g 4℃离心3 min收取细菌。加入变性液[5　mmol/L imidazole, 0.5 mol/L NaCl, 20 mmol/L tris-HCl (pH 7.9), 6 mol/L Urea]悬浮沉淀, 以超声细胞破碎仪裂解细菌。10000　g 4℃离心3 min, 取上清, 以BCA　(bicinchoninic acid)方法测定蛋白浓度。通过12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis, pAGE)观察不同克隆菌株中GST-hHSS表达。 　　1.3 GST-hHSS存在部位及表达形式的确定取高表达克隆菌株, 按方法1.2中步骤诱导GST-hHSS融合蛋白的表达, 离心制备细菌沉淀,提取可溶性蛋白和包涵体蛋白。取诱导前细菌总蛋白、诱导后培养液上清、 诱导后可溶性蛋白和包涵体蛋白各50 μg, 经12%　SDS分离,用考马斯亮蓝(R-250)染色, 观察融合蛋白表达部位与形式。另取上述平行样品蛋白各5 μg ,按照狭缝杂交法将蛋白印渍于尼龙膜。该膜经5%脱脂奶粉过夜封闭(4℃), 次日与抗多聚组氨酸(His·Tag)抗体(Novagen)杂交1 h,继而再与辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG(Sigma)孵育1 h。之后, 将膜充分漂洗, 迅速加入发光试剂(Santa Cruz) 进行化学发光(enhanced chemiluminescence, ECL), 检测杂交信号强度。 　　1.4 GST-hHSS融合蛋白的纯化与含量的测定 将方法1.3中提取的可溶性蛋白和包涵体蛋白, 以0.45 μm滤膜过滤, 按His·Tag亲合层析方法分离融合蛋白。融合蛋白的His·Tag与亲合层吸柱中Ni2+发生耦联而被吸附,先以低浓度咪唑液(60 mmol/L)洗脱去除杂蛋白, 再以高浓度咪唑(1 mol/L)洗脱亲合的目的蛋白, 即可获得纯化的GST-hHSS融合蛋白。取诱导前细菌总蛋白(30μg)、 未纯化的细菌可溶性蛋白及包涵体蛋白(各30 μg)、 纯化的可溶性融合蛋白及包涵体融合蛋白(各3 μg), 经12% SDS电泳分离,用考马斯亮蓝(R-250)染色。以GS-700密度扫描蛋白条带密度, 计算GST-hHSS融合蛋白占BL-21菌体蛋白的百分含量。 　　1.5 GST-hHSS融合蛋白酶