解剖小白鼠实验介绍.pptVIP

细胞原代培养(Cell primary culture) 实验目的 了解细胞体外培养的原理、基本方 法，了解无菌操作方法及注意事项。 学习观察体外培养细胞的形态及生长 状况。 实验原理 用直接从机体获得的细胞进行的培养称为原代培养。这种培养过程主要是采用无菌操作的方法，把组织（或器官）从动物体内取出，经酶消化处理，使分散成单个细胞，然后在人工条件下培养，使其不断地生长和繁殖。原代培养是建立各种细胞系的第一步。 消化培养法 又称为组织消化分散法：将妨碍细胞生长的细胞间质去除，使细胞分散，形成悬液，按不同浓度接种培养瓶培养。  实验仪器 超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸 CO2培养箱 倒置显微镜 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器 超净台 超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器，除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。 滤 器 滤器工作原理 CO2培养箱 CO2培养箱设定的条件为37 ℃ ，5％CO2 。 使用CO2培养箱应注意的问题： ①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。 ②保持培养箱内空气干净。定期消毒（90℃ ，14 h)。 ③箱内无菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。 倒置显微镜 自动双重纯水蒸馏器 纯水仪 培 养 板 培养瓶 实验材料 2月龄的小鼠 实验试剂 （1） 1640-RPMI培养液 （2）? 小牛血清 （3）? 青、链霉素 （4） PBS液 （5）? 5％NaHCO3 （6）? 75％酒精 实验步骤 一、培养前的准备工作 （1）? 清洗与消毒 （2）? 配制溶液 （3）? 紫外线消毒 （4） 洗手和着装 （5） 进入无菌室 实验步骤 动物细胞原代培养过程图 方法与步骤 （1）动物拉椎处死 （2）取肝及剪碎：剖开腹部，将肝脏取出，放入小培养皿中，用PBS液洗涤1次；将肝剪成1mm大小的块，再用PBS液洗涤2次，直到液体澄清。 （3）消化及分散组织块：将上述清洗过的组织放入试管内，加入的0.25％胰蛋白酶液，完全没过组织，置37℃水浴中消化20 ～ 30min，每隔10min摇动一次，直到组织块变得疏松，粘稠，且颜色略变为白色为止。取出试管，吸去胰蛋白酶液，加入5ml培养液，用吸管反复吹打组织块，使其分散成细胞悬液，取上清液至另一试管中。 （4）观察与计数：从细胞悬液中取出1滴滴于载玻片上，显微镜下观察细胞的数目。看到球型的细胞，证明消化下来细胞，实验成功。 作业: 1.在细胞培养过程中如何防止污染? 无菌操作的几个注意事项 1、操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。 2、点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。 3、操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。 4、不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。 5、瓶子开口后要尽量保持45°斜位。 6、吸溶液的吸管等不能混用。 7、自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。 8、在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。 9、凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。