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本论文获得以下结果：
1．SmglmU基因的扩增和克隆
rodl55菌株
smegmatis
从TIGR基因数据库(丛!卫：丛坠坚塑：鱼g!：Q!g』!d蚴获得M
glmU基因的核苷酸序列设计引物，用高保
的glmU基因的核苷酸序列。根据Sm
真LA DNA聚合酶从mc2155基因组中扩增Sm
Yaq glmU基因及其上游约500bp
M13引物对Sm
致的克隆质粒。
2．条件性复制质粒pPR27-xylE-Sm
glmU：：Kan8的构建
将来自于质粒pUC4K的Kan“克隆到SmglmU基因内部，产生Sm
glmU：：Kan8突变基因。将砌T
建出条件性复制质粒pPR27-xytE—Sm
够分解蔗糖，产生对细菌生长有害的聚果糖，使细菌死亡。驯陋基因产物是儿茶
酚2，3．氧化还原酶，它能氧化儿茶酚成黄色的化合物，使菌落呈现金黄色。
3．营救质粒的构建
’营救质粒携带正常的Mtuberculosis
glmU基因，其作用是在me,2155gtmU
DNA聚
Taq
基因敲除菌株中补偿突变的glmU基因的功能。本实验用高保真LA
tuberculosis
合酶分别从M H37Rv菌株基因组中扩增Tb
glmU基因，构建营救质
粒pCG76一Phsp60．Tb
型复制子，即该质粒在30。C条件下可以复制，在42。c条件下不能复制。Tb
弼G7甜峪乃咖U营救质粒用于证明砀曲U是否为分枝杆菌生长相关基因。
4．第一次同源重组突变菌株mc2155
glmUSCO一1的筛选
将条件复制性质粒pPR27-xylE-Sm
中。依据pPR27．xylE-Sm
pPR27-xylE．SmgImU．‘：Kan“质粒的Sm
glmU发生同源重组，使Sm
me2155基因组中。用地高辛标记的Sm
2
first
期的杂交条带为发生第一次同源重组的突变菌株me2155SCO一1(the
glmU
crossover)。
single
5．第二次同源重组突变菌株mc2155
将携带Tb SCO一1感受态细胞
glmU基因的营救质粒转化到me2155glmU
glmUSCO．1，由于pPR27-xylE-Sm
至lJmc2155
glmU
解蔗糖，产生引起mc2155SCO．1致死的聚果糖，在这种选择压力下，
glmU
mc2155
glmU
SCO一1基因组中的跏glmU．．Kan8与SmglmU发生第二次同源重
KOT突变菌株中表达出Tb
glmU GImU蛋白质，从而补偿基因组上失活的Sm
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