03第三章节 吸附层析.ppt

第三章 吸附层析 吸附层析(adsorption chromatography)又称色层法或色谱法。 目前，这种方法已作为纯化或鉴定各种化合物的一种重要手段。 植物色素溶液石油醚洗涤 1903年俄国植物学家茨维特首先将磷酸钙细粉装入玻璃管内使其成柱形，然后把石油醚抽提的植物色素溶液倾入，让其通过碳酸钙柱，接着用石油醚洗涤发现，各种色层彼此可分开，柱上端呈黄色，较下端呈绿色，这就是早期的吸附层析 层析类型 层析方法可根据不同的标准分成若干类型： 按流动相分类：液相层析和气相层析； 按固定相“床”的形式分类：柱层析、薄板(层)层析、薄膜层析等等，详见表3~1。 第一节 吸附柱层析 吸附柱层析： 是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱状的一种层析方法。 常用的吸附剂有：极性的和非极性的两种 极性的有：羟基磷灰石、硅胶、氧化铝、人 造沸石等， 非极性的有：活性炭等。 一、常用术语 1．固定相 固定相是由层析基质组成的。 其基质包括：固体物质(如吸附剂、离子 交换剂) 液体物质(如固定在纤维素 或硅胶上的溶液)， 这些物质能与相关的化合物进行可逆性的吸附、溶解和交换作用。 2．流动相 在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体称为流动相。 在柱层析时，流动相又称洗脱剂或洗涤剂(即推动有效成分或杂质向一定方面移动的溶液)。 在薄层层析时，流动相又称展层剂。 3．层析 以基质为固定相(柱状或薄层状)， 以液体或气体为流动相， 有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行分配、吸附或交换作用， 最终结果是使混合物得到分离。 4．操作容量 即在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量； 一般以每克(或毫升)基质结合某种成分的毫摩尔数或毫克数来表示。(mmol/g, mg/g, mmol/ml, mg/ml) 其数值大，表明基质对某种成分的结合力强；否则反之。 5．床体积(Vt) 通常床体积是指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积(Vt)。 Vt是基质的外水体积(V0)和内水体积(Vi)以及自身体积(Vg)的总和，即: Vt = V0+ Vi + Vg (详见图3-1) 6．洗脱体积(Ve) 洗脱体积是指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大值时的流动相体积。用Ve表示(见图3-7中OB)。 7．外水体积(V0) 外水体积指基质颗粒之间体积的总和。 8．内水体积(Vi) 内水体积是指基质颗粒内部体积的总和。 9．基质体积(Vg) 基质体积是指基质自身所具有的体积。 V0、Vi 、 Vg都是随着床体积和基质性质变化而变化的。 10．膨胀度 在一定溶液中，单位重量的基质充分溶胀后所占有的体积用Vβ表示。即每克溶胀基质所具有的床体积。 Vβ = Vt / g 一般亲水性基质的膨胀度比疏水性的大。 11．分配系数和迁移率 分配系数(K): 是指一组分在固定相与流动相中含量的比值，常用K表示。 迁移率: 是指一组分在相同时间内，在固定相移动的距离与流动相移动距离之比值，常用Rf表示。 K值大，就表明该组分与固定相结合力大，迁移率小； 反之则结合力小，迁移率大。 不同物质的分配系数和迁移率是不一样的。 几种物质之间的分配系数或迁移率,其差异程度越大，分离效果就越好。 二、基本原理 在吸附层析法中，使用的固定相基质是颗粒状的吸附剂。 在吸附剂的表面存在着许多随机分布的吸附位点； 吸附位点通过范德瓦尔力(中性分子彼此距离非常近时，产生的一种微弱电磁引力)和静电引力与蛋白质和核酸等生物分子结合； 其结合力的大小与各种生物分子的结构和吸附剂的性质有密切关系。 例如 把含结构不同的A、B二种物质的混合溶液加至装有吸附剂的层析柱(见图3-2)； 而后，注入适宜的洗脱剂，控制速度让其下流； 便可借助A、B两种物质对吸附剂结合力的差异性，将它们二者分离。 假如吸附剂对A的结合力小于B时，则B留在柱子上部，A移至柱子的下部。 也可以说，A、B二物质在柱上得以分离，是由于A、B二物质在固定相(吸附剂)与流动相(洗