BMSCs条件培养基对神经干细胞增殖与分化的影响.docVIP

　　BMSCs条件培养基对神经干细胞增殖与分化的影响 　　神经干细胞（neural stem cells,NSCs）是一类分布于神经系统，具有自我更新并拥有多向分化潜能的干细胞，其主要分化为星形胶质细胞、神经元细胞及少突胶质细胞，替代受损的神经组织从而起到治疗脊髓损伤的作用[1 -2].骨髓间充质干细胞（bonemarroesenchymal stem cells,BMSCs）属于成体干细胞的一种，不仅具有成骨、成脂等多向分化潜能，还能分泌多种神经营养因子[3],近年来利用 BMSCs与 NSCs 共培养技术治疗脊髓损伤已成为研究热点。有报道[4]指出，BMSCs 与 NSCs 共移植治疗神经损伤疗效优于单纯移植 NSCs,说明 BMSCs 为NSCs 的生长与分化提供了一个更加合适的微环境。 　　然而，是 BMSCs 本身还是其分泌的营养因子发挥了作用仍值得探讨。该研究利用富含营养因子的BMSCs 条件培养基体外培养 NSCs,去除 BMSCs 本身的影响，能够充分了解 BMSCs 条件培养基对NSCs 增殖与分化的影响，为 BMSCs 条件培养基的应用提供实验依据。 　　1 材料与方法 　　1. 1 材料 　　1. 1. 1 实验动物 新生 24 h 内 SD 大鼠 1 只，雌雄不限；4 ~5 周龄 SD 大鼠1 只，100 ~120 g,购自安徽医科大学实验动物中心。 　　1. 1. 2 实验试剂及仪器 DMEM /F12 培养基（ 美国 Gibco 公司）；DMEM 低糖、南美胎牛血清（美国HyClone 公司） ;B-27（ 美国 Invitrogen 公司）；表皮生长因子（epidermal groicrotubule-associatedprotein-2,MAP-2）（美国 SantaCruz 公司）；小鼠抗大鼠髓鞘碱性蛋白（ myelin basicprotein,MBP）（英国 Abcam 公司）； FITC 标记的山羊抗小鼠 IgG、TRITC 标记的山羊抗兔 IgG、TritonX-100（北京中杉金桥生物技术有限公司）；CD29-PE、CD90-PE、CD34-FITC、CD44-FITC（美国 BioLegend公司）；多聚赖氨酸（美国 Sigma 公司）；MTT 试剂盒、胰 酶、免 疫 荧 光 稀 释 液、多 聚 甲 醛、Hoechst33342、青链霉素（ 100） （ 上海碧云天生物技术有限公司）；山羊血清（中国武汉博士德公司）；ECL 显示试剂盒（美国 Pierce 公司）；CO2恒温培养箱（美国SHEL LAB）；倒置显微镜 CKX41 （ 日本 Olympus 公司）；流式细胞仪（美国 BD FACSVerseTM）；荧光显微镜 DMI6000 型（德国 Leica 公司）。 　　1. 2 方法 　　1. 2. 1 大鼠 BMSCs 体外分离、培养、鉴定 采用本课题组前期的实验方法[5]从大鼠骨髓中分离并培养出 BMSCs,取生长良好的第 3 代 BMSCs,胰酶消化后制成单细胞悬液，计数，参照之前的方法，行细胞表面标记 CD90、CD34、CD29 的流式细胞仪检测。 　　1. 2. 2 大鼠 BMSCs 条件培养基的制备 取第 3 代生长良好的 BMSCs,待细胞长至约 90 % 密度时，弃去原培养基，PBS 洗涤 3 次，每次 5 min; 加入DMEM / F12 培养基继续培养 48 h 后，收集浓缩上清液，按前期实验比例配制成 NSCs 增殖与分化条件培养基。 　　1. 2. 3 大鼠 NSCs 的分离、培养、鉴定 取新生 24h SD 大鼠幼鼠，处死后置于 75% 酒精浸泡 5 min;在无菌条件下分离出大脑半球，剪碎，加入 0. 25% 胰酶消化 10 min,轻轻吹打混匀后经筛X过滤成单细胞悬液；加入增殖培养基（DMEM/F12 +2%B27 +20ng / ml bFGF + 20 ng / ml EGF + 链霉素 0. 1 mg / ml +青霉素 100 U/ml），600 r/min 离心 5 min 2 次，弃上清液；吹打混匀后以 3 105/ ml 接种于培养瓶中，置于 37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每 3 d 半定量换液1 次，培养 7 d 后传代。 　　取第 2 代培养 7 d 的细胞球，600 r/min 离心 5min,弃上清液，接种于经 0. 1 mg/ml 多聚赖氨酸包被盖玻片的 6 孔板中，置于 37 ℃培养箱 6 h,使悬浮干细胞贴壁。用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 min;4%多聚甲醛固定后，PBS 洗涤 3 次，每次 5 min.在含0. 3% TritonX-100 中孵育 10 min,PBS 洗 3 次后，加入正常山羊