第三章节 电泳技术-张静.pptVIP

第三章 电泳技术 电泳技术的基本知识 一、定义 电泳—带电粒子在直流电场中向着电性相反的电极方向移动的现象。 电泳技术—利用电泳现象进行物质分离的技术。 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面) 醋酸纤维素薄膜电泳装置 醋酸纤维素薄膜电泳的应用： 医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，其优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。 第五节 凝胶电泳 凝胶电泳主要分为： 聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳， 琼脂糖凝胶电泳主要应用于核酸的分离纯化， 聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于蛋白质和小分子核酸、 1、机械强度高，透明 2、原料成分纯度高，制凝胶的重复性好 3、凝胶孔径可调 4、化学稳定性和热稳定性好 5、电渗作用小 6、电泳分辨率高 1、pH梯度形成的机制 载体两性电解质既有酸性基团(—NH2＋－)，也有碱性基团(—COO－)，既可接受质子，也可释放质子。 在制备聚丙烯酰胺凝胶时，将其混溶其中。电泳时凝胶板正极的电极液是磷酸，负极是氢氧化钠。 ◆◆正极是酸性环境，载体两性电解质都带正电荷，但由于pI的不同，其所带正电荷数量就有所差异，电泳时，向负极泳动的速度也就因此不同。 2、两性电解质载体 两性电解质载体是用多烯多胺和不饱和酸合成的脂肪族多氨基多羧基化合物的混合物，其中不同的分子因氨基和羧基比例不同而具有不同的pI。 目前，两性电解质载体由于生产厂家不同，合成方式各异而有不同的商品名称，如Ampholine(LKB公司)、Servalyte(德国Serva公司)、Pharmalyte(Pharrnacia公司)。国内生产的均称为两性电解质载体，生产厂家有上海东风生化试剂厂、北京军事医学科学院等。 一般溶液浓度为40％或20％，其pH范围分别为：2.5～5，4～6.5，5～8，6.5～9，8～10.5，3～10等。 两性电解质载体是IEF中最关键的试剂，它直接影响pH梯度的形成及蛋白质的聚焦。 因此，要选用优质两性电解质载体，在凝胶中，其终浓度一般为1％～2％。 pH梯度的线性依赖于两性电解质的性质，选择哪种pH梯度范围的两性电解质载体，则与被分离蛋白质的pI有关。 3、pH梯度支持介质 常用的pH梯度支持介质有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等，其中聚丙烯酰胺凝胶为最常应用。 琼脂糖凝胶（agarose gel ），依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化。 举例：等电聚焦电泳分离蛋白质 一、仪器与试剂 1．仪 器： JY5000电泳仪、DYCP32型电泳槽 2．试 剂：蛋白质样品、载体两性电解质、 琼脂糖、溴酚蓝、蒸馏水 电极液：0.5M醋酸溶液（阳极液）、 0.5M氢氧化钠溶液（阴极液） 等电聚焦电泳分离蛋白质 二、操作步骤： 1、配胶 胶液组成：载体两性电解质（pH3.5-9.5）1.0mL+样 品+溴酚蓝一滴+蒸馏水8.5mL+琼脂糖0.1g 2、灌胶 将胶液升温至75℃，保温将胶液灌到塑料管中。灌胶过程注意不要产生气泡。冷却两小时后可接入电泳池。 等电聚焦电泳分离蛋白质 3、加电极液 阴阳两极分别加入80mL电极液。阳极：0.5M醋酸溶液，阴极：0.5M氢氧化钠溶液。两边均需没过胶管头。 4、电泳 使用JY5000电泳仪，调整电流，使功率保持在1-2W左右。电流开始较大，聚焦过程有所下降。当每条管中的溴酚蓝集中成一点时，停止电泳。整个电泳过程约6个小时。 等电聚焦电泳分离蛋白质 5、样品收集 将胶管以溴酚蓝点为中心，分别切为1cm的小段。然后将胶管中的胶体分别挤入5mL的离心管中，每个离心管分别加入4mL去离子水，在90Hz下超声3小时。 用于进一步检测。 等电聚焦电泳分离蛋白质 三、注意事项 1、两性电解质是等电聚焦的关键试剂,它的含量 1﹪-2﹪较合适。使用完毕之后，请及时放入冰 箱中保存。 2、灌胶过程中，注意塑料管中不能有气泡，否则电 泳时离子无法通过。 3、电泳时，电泳槽中一定要加上盖子，否则胶体会 胀出塑料管外 。 4、所有水都用去离子水。 5、电泳过程中，功率是不断变化的，要注意随时调 整。 CH2=CH COOH CH2-CH2 NH CH2-CH2 NH CH2-CH2