精选分子生物学方法.pdfVIP

四、基因工程中的一些主要分子生 物学方法 （一）凝胶电泳技术 （二）杂交技术 （三）多聚合酶链式反应 （一）凝胶电泳技术 用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶作为支持物介质 的区带电泳称为凝胶电泳。 常用的凝胶电泳有两类 ： 琼脂糖凝胶电泳：分辨率稍低，分离DNA 片段大 小范围较广，适于较大分子 。 聚丙烯酰胺凝胶电泳：分辨率高，适于较小分子。 1. 琼脂糖凝胶电泳的原理 分离原理： 电荷效应 DNA分子带负电荷，向正极移动。 分子筛效应 迁移速度与分子质量的对数值成反比。 检测原理： 溴化乙锭（EB）在紫外照射下发荧光，且荧光含 量与DNA含量呈正比。 2.琼脂糖凝胶电泳的影响因素 （1）DNA分子大小 线状双链DNA分子长度（碱基对数目bp ）的对 数（log10 ）与迁移距离成反比，以此来测定DNA 片段（线性双链）的分子量准确且方便。 EB嵌合使迁移率下降15%。 （2 ）DNA分子的空间构型 即使分子量相同，构型不同，其迁移率也不同。 DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大，超 螺旋DNA移动最快，而线状双链DNA移动最慢。 （3）琼脂糖浓度 凝胶浓度越小，孔径越大，浓度越大，孔径越小 。 不同浓度琼脂糖凝胶的有效分离范围 浓度% （W/V ） 线状DNA分子的有效分离范围（kb ） 0.3 5－60 0.6 1－20 0.7 0.8－10 0.9 0.5－7 1.2 0.4－6 1.5 1.2－3 2.0 0.1－2 （4 ）电源电压 在低电压时，线性DNA 片段的移动速率与所加 电压成正比，但电压增高，不同分子量的DNA 片段 的移动速率将以不同幅度增加；片段越大，升高的 幅度也越大。因此电压增高，琼脂糖有效分离范围 将缩小。一般所加电压不得超过5V/cm. （5）染料 溴化乙啶（EB ），它可嵌入堆积的碱基对之间， 在紫外灯下发荧光，检测DNA的下限可达1-10ng。 注意：EB是强诱变剂！ EB的替代物： GoldView DNA染料是一种可代替溴化乙锭（EB ）的新型 DNA染料，使用方法与之完全相同。采用琼脂糖凝胶电泳 检测DNA时，GoldView与核酸结合后能产生很强的荧光信 号，其灵敏度与EB相当，在某些波段甚至超过EB。在 100ml琼脂糖胶溶液中加入5 μl GoldView 即可。在紫外灯下 双链DNA呈现绿色荧光，而单链多聚核酸链呈红色荧光。 因此，GoldView不仅能染双链DNA ，也可用于染RNA和单 链DNA 。GoldView DNA染料在不同的波长下灵敏度有一定 影响，建议使用312nm波长。 弱点:它的荧光基团在紫外灯下非常容易淬灭，一般5-10min 条带就会消失。 （6）电泳缓冲液 pH值：决定带电颗粒的解离程度，缓冲液pH常偏 碱性或中性，8.0左右，此时核酸分子带负电，向正 极移动。 离子强度：离子强度小，溶液的导电性小，带电颗 粒泳动慢 ；离子强度大，溶液的导电性高，带电颗 粒泳动快（过高，产生大量热，胶熔化，或使DNA 变性。 常用的离子强度为0.02-0.05。 种类： TAE （Tris、醋酸、EDTA ）：缓冲能力差，电流 大易发热，长时间使用阴极为碱性 ，阳极为酸 性 ，需要循环使两极的pH一致；但价格便宜。 TBE （Tris、硼酸、EDTA ）：缓冲能力强。首选 TBE。 TBE一般