第2节+++聚合酶链式反应-PCR.pptVIP

七、荧光定量PCR 荧光定量PCR（也称TaqMan PCR,以下简称FQ-PCR）是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，与变通PCR相比，FQ-PCR具有许多优点。 （一）、荧光定量PCR技术定义 是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 二、荧光定量PCR原理 1.??Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 —— Ct值。C代表Cycle，t代表threshold（域值），Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。故必须确定Ct值。 2.?????荧光域值（threshold）的设定 ?PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍， 即：threshold = 10 × SDcycle 6-15 （三）、荧光定量PCR技术优点 1、全封闭的PCR过程，无需跑胶，无需后处理； 2、有效解决PCR污染问题 3、实时在线控制； 4、特异性更强； 5、增加定量的精确性； 6、线行关系直接； 7、自动化程度高，分析结果快速方便。 （四）、荧光定量PCR技术的应用 基因表达研究 转基因研究 药物疗效考核 病原体检测 肿瘤研究 基因突变及多态性的研究 Insert EcoR1 Xho1 1.9kb pCMV-Myc-T10 Primer 1(From pCMV-Myc827-847): 5’TTC C A AGC TTC ACC ATG GCA TCA ATG CAG AAG C 保护性碱基 HindIII Myc tag Tm=4（G＋C）＋2（A＋T）＝ 4×12＋2×11＝700C. Primer 2(From T10 1249-1270): 5’TCG C GG ATC CAG TGG CAT CAG AGA CTT GCT AAT C 保护性碱基 BamH I Tm=4（G＋C）＋2（A＋T）＝4×11＋2×13＝700C. PCR Mixture: Template DNA: 1 ?l (10ng) Primer 1: 1 ?l (10?M) Primer 2: 1 ?l (10?M) dNTPs: 4 ?l (2.5mM) Taq DNA polymerase: 0.5 ?l(5U/?l) 10×buffer（Mg+）: 5 ?l ddH2O: 37.5?l 50 ? l PCR条件： 94℃变性5min后开始以下循环 94℃变性反应45 sec； 65℃退火反应45 sec； 72℃延伸反应1 min； 进行30个循环； 最后72℃反应7min； 4 ℃冷却恒定。 五、PCR产物分析 取3-5?l PCR产物，采用1.2％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的量、引物扩增的特异性。并可根据标准DNA的量粗略计算PCR产物的总量。 PCR结果： 0.8kb DNA Marker PCR product 3.0kb 六、PCR污染与对策 （一）、污染原因 　　1、标本间交叉污染: 收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染; 标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染; 有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染. 　　2、PCR试剂的污染: 主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水 及其它溶液被PCR核酸模板污染. 3、PCR扩增产物污染 （1）、PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性. （2）、气溶胶污染。在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样 枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶