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综述:核酸检测技术 综述:核 酸 检 测 技 术 核酸检测技术越来越成为分子生物学实验中的必备技术之一，而且在实际 应用中也在不断地扩大其应用的领域。诸如检测环境中的病原微生物，临床疾病 的诊断，法医鉴定，转基因动植物中外源基因的检测等等。核酸检测技术在本质 上都是利用两条核酸在相互互补的区域可以形成精确配对，并形成稳定的双螺旋 结构这一特性的。这些检测技术可以总体上分为两大类:靶扩增技术及信号扩增 技术((1)。有时也将靶扩增技术再细分为目标靶扩增和探针扩增(z)。本文中采用 前者，即两类分法。 靶扩增技术包括多聚酶链式反应 (polymerasechainreaction,PCR)，链替代 扩增反应(stranddisplacementamplification,SDA)，连接酶链式反应(ligasechain reaction,LCR)，基于核酸序列的扩增反应 (nucleicacidsequence-based amplification,NASBA)，滚环扩增 (rollingcircleamplification,RCA)。信号扩增 技术有分支DNA技术(branchedDNA,bDNA),Tyramide信号扩增(tyramidesignal amplification,TSA),侵入式信号扩增(invasivesignalamplification)，还有RCA. 特别要提到的是RCA技术即可进行把扩增，也可用来进行信号扩增。本文将对 以上各技术作一综述。 一 靶扩增技术 1.PCR PCR(3)技术依然是使用最为广泛的核酸扩增技术，它是利用一对与靶序列 互补的引物在热稳定DNA聚合酶的作用下，通过不断的变性，复性，延伸，经 过一定时间将该对引物之间的序列以指数形式扩增，其扩增倍数可以达到 10(4).PCR技术是任何一个进行涉及核酸研究的实验室所必备的技术，而且各 种用于PCR反应的高保真酶、适于长序列扩增的酶、及适于快速PCR反应的耐 热DNA聚合酶都可以方便地从各生物公司购得。 在普通PCR技术的基础上，为了适应不同的需要又衍生出其他的技术。比 如反转录PCR(RT-PCR)，它直接以RNA为模板进行扩增;还有原位PCR(in situPCR)，可以在保持细胞大体形态不被破坏的前提下，对DNA进行原位扩增; 转基因植物检测体系建立 另外还有复合式PCR技术 (multiplexPCR)(5)，它是在同一反应体系中含有多 对引物，可同时对多个靶系列进行扩增，效率比普通PCR高。 常用的PCR产物检测技术是凝胶电泳，通过产物分子量不同进行分离，然 后再用澳乙锭染色，在紫外灯下就可用肉眼进行观察。不过以上方法对原位PCR 不适合，此时可对PCR产物进行同位素标记，再对X光片曝光来观察反应结果。 同杂交技术的结合不仅是PCR检测技术也是其他核酸扩增技术的一种发展方向 (6)。它可以提供比单纯扩增方法更多的信息，而且结果也更加可靠。 比如MPCR同点杂交结合可以方便地对其产物进行鉴定，即使因多对引物 互相干扰而产生假阳性DNA也因其无法同序列特异性探针结合而不影响最终检 测结果的正确性((7-8)oT-naa9)g( 和分子信标 B〔eacon)(10)是另两个例子，它们 利用杂交的特异性及荧光标记的灵敏性对扩增产物进行实时监测，提高了检测特 异性，缩短了整个试验的时间;已在许所方面得到应用((11-14)0 2.SDA SDA反应((15)是利用两对引物 (Bt.B2、和SI,S2)以及无外切酶活性的 DNA多聚酶和一种限制性内切酶(如HincII)联合作用之下，在恒温下对靶DNA 进行扩增。如图1所示，引物B:和氏分别同相应的靶位点互补，在反应中起到 链替换的作用;引物S,和S2在其3’端同相应靶位点互补，在5端则含有HincIl 的识别序列 (5-GTTGAC);S,和S:的结合位点分别在相应的Bt和B2结合位 点的下游。靶DNA经变性后在过量四种引物存在下复性后，四引物同各自靶位 点结合，DNA聚合酶利用dGTP,dCTP,dTTP和dATPaS进行链延伸反应;位于 上游的B,和B:引物的延伸产物将位于下游的S,和S2引物的延伸产物从其合成 位