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实验项目：柱层析分离甲基橙和次甲基蓝染料 实验目的 1．了解柱色谱分离有机化合物的原理； 2．初步掌握色谱柱装填和洗脱的操作方法。 实验内容 1．用中性Al2O3为固定相装填色谱柱； 2．依次以95%乙醇和水作洗脱剂分离次甲基兰和甲基橙。 实验示意图 柱层析分离装置 湿法装填色谱柱→加次甲基兰和甲基橙混合液→用95%的乙醇洗脱→分出蓝色色带层(次甲基兰)→改为水洗脱→收集黄色色带层(甲基橙)。 实验用主要仪器设备、消耗品 仪器设备名称 规格 消耗品名称 规格 　色谱柱 次甲基蓝 工业纯 　锥形瓶 　50,100,150,250ml 甲基橙 自制 　滴液漏斗 　250ml 乙醇 95％ 　铁方座 Al2O3 柱色谱用（中性） 　铁夹 　铁圈 　量筒 10ml,100ml 　台秤 实验原理及原始计算数据、所应用的公式 吸附柱色谱通常在玻璃管中填入表面积很大，经过各种活化的多孔性或粉状固体吸附剂。当混合物溶液流过吸附柱时,各种成分同时被吸附在柱的上端,当洗脱溶剂流下时,由于不同化合物吸附能力不同，于是形成了不同层次，即溶质在柱中自上而下按对吸附剂亲和力大小分别形成若干色带，再用溶剂洗脱时，已经分开的溶质可以从柱上分别洗出收集。对于柱上不显色的化合物分离时，可用溶剂洗脱时分别收集洗脱液，逐个加以鉴定。 1．从分子结构看出,甲基橙中含—SO3Na基团,它具有比次甲基兰更大的极性，因此在用乙醇洗脱时只有次甲基兰可被洗脱下来，极性较大的甲基橙必须用水作洗脱剂。 2．装柱的紧密与否,样品吸收带是否狭对柱层析分离影响颇大. 加入样品量不宜过大,否则会引起过载,分离效果不好,将含样品的溶液进入吸附柱时,必须待样品液全部被吸附剂吸附后,才能用少量洗脱剂洗涤,洗涤液又全部进入柱后,才能开始用大量溶剂洗脱,否则样品色带宽大,在洗脱过程中,会因扩散现象造成色带彼此重叠,使分离难以进行。色谱柱装填要紧密、均匀,疏松或不均匀的柱子均会引起涌流扩散现象,导致分离效果欠佳。 3．洗脱速度要保持在1滴/秒，速度过快，物料还来不及平衡，影响分离效果；过慢，会导致柱内扩散现象严重，均会影响分离效果。 实验数据记录 1．用95%乙醇洗脱分出蓝色色带，得次甲基兰 2．然后改用水洗脱分出黄色色带，得甲基橙 实验结果计算及曲线 ⒈吸附剂 柱层析常用吸附剂有氧化铝,硅胶, 氧化镁,碳酸钙及活性炭等, 吸附剂要求颗粒大小均匀,越细分离效果越佳,但此时洗脱阻力也会增大,所以要选择颗粒大小合适的吸附剂. 氧化铝分酸性、中性和碱性三种，本实验应用中性氧化铝。 吸附剂的活性根据其含水量而定。 吸附剂活性等级 含水量 Ⅰ 0% Ⅱ 3% Ⅲ 6% Ⅳ 10% Ⅴ 15% 所以为了提高吸附剂活性,可以用加热脱水的方法来获得。 ⒉溶剂 化合物的吸附能力与它的极性成正比，具有较大极性基团的化合物，其在吸附剂上吸附能力较强。 氧化铝对各化合物的吸附性按以下次序递减： 酸醇,胺,硫醇酯,醛,酮烃 卤化物,醚烯饱和烃 强吸附性的化合物要用强极性溶剂来洗脱。 作为洗脱剂的溶剂要求其具有一定极性,适合于被分离物的分离,体积尽量要小,此外要求易挥发,易除去(乙醚等挥发性太大的溶剂不合适)。 洗脱剂的极性按下列次序递增： 乙烷或石油醚环己烷四氯化碳三氯乙烯二硫化碳甲苯苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸乙酯丙酮丙醇乙醇甲醇水吡啶乙酸 ⒊样品:吸附剂=1:30---40 柱长:直径=7.5:1 一般为湿法装柱。 次甲基兰的紫外光谱 甲基橙的紫外光谱 对实验结果和实验中某些现象的分析讨论 吸附色谱柱的分离效果不仅依赖于吸附剂和洗脱溶剂的选择,而且与制成的色谱柱有关;要求柱中的吸附剂用量为被分离样品量的30-40倍,若需要可增至100倍。 柱高与直径之比为4:1至10:1,一般为7.5:1。实验室常用的色谱柱,其直径在0.5-10cm之间。当吸附物的色带占吸附剂高度的1/10—1/4时，此色谱柱已经可作色谱分离了。色谱柱或酸式滴定管的活塞不用涂润滑脂。 装柱可以采用湿法或干法，干法装柱是将干吸附剂倒入柱内，填装均匀， 然后加入少量溶剂。无论采用哪种装柱都不要使吸附剂有裂缝或气泡，否则影响 分离效果，一般说来湿法装柱较干法紧密均匀。 本实验采用湿法装柱。 1、色带有重叠现象，即柱内出现彩色色带，这是