RKB%2fAkt在斑马鱼早期胚胎发育中的功能研究与分析.pdf

中国海洋大学硕士学文论文 PKB／A1(t在斑马鱼早期胚胎发育中的功能研究与分析 摘要 kinase 蛋白激酶B(ProteinB，Pl④)也被称为Akt，是一种丝／苏氨酸激酶。 它参与调节新陈代谢、细胞增殖、细胞存活以及细胞分化等重要的细胞生理活动。 而且，PKB／Akt是IGFl重要的下游分子之一，预示着它在生长发育和胰岛素功 能的调节中扮演着关键角色。在哺乳动物中，已经发现了PKB家族的三个成员， 十分保守。但据已有的研究结果分析，三者在活体内的功能有互补也有差异： Aktl删除导致小鼠新生死亡或者整体缩小；Akt2缺失会引发糖尿病；Akt3与出 生后脑部尺寸有关。并且在敲除其中一种时，其余两者的表达水平未见明显升高， 补偿作用也不明显，说明其功能具特异性。虽然PKB／Akt的研究已经十分广泛 和深入，但是对该家族在早期胚胎发育中的功能还不明确。而且，小鼠的宫内发 育模式，不便于早期发育的观察。所以我们利用斑马鱼胚胎体外发育、早期透明 及便于基因操作等优势，围绕着PKB对早期胚胎发育的影响进行研究和分析。 PKBa／Aktl是生物体内分布最广泛，也是研究得最多的PKB成员。目前在 斑马鱼中，只克隆得到了akl2与akt21ike，其功能及其他成员的研究尚未见报道。 mRNA并注射到斑马鱼胚胎内过表 所以我们合成了持续激活的小鼠myr-Aktl 达，观察并分析了akll在早期发育过程中的作用。过表达后的表型分析显示， 小鼠Aktl对早期胚胎的影响主要集中在脑部，表现为相对脑厚度和相对脑长度 后，可见脑部尺寸恢复到与对照组无差异的水平。在进一步分析了细胞增殖、细 胞命运决定和细胞凋亡后发现，过表达rayr-Akt，对细胞增殖没有影响，对细胞 命运决定也没有影响，只是显著减少了脑部的自发性细胞凋亡，这可能是其增大 脑部尺寸的方式之一。并且，我们还发现，过表达myr-Akll在活体内对热激处 理和UV照射处理引发的神经元凋亡具有抵抗作用，具有神经保护作用。这些结 中国海洋大学硕士学文论文 果是Aktl对早期胚胎发育影响的直接证据。并且说明PKBa／Aktl不仅对生物的 整体生长发育调控有关，也对脑部的发育和大小有特异的影响。 随后，我们采用RT-PCR和RACE相结合的方法，克隆得到了斑马鱼的 Akt家族成员间保守的PH结构域、催化活性结构域和调节结构域以及两个保守 表达量开始逐渐上升，至60hpf-96hpf贝q稳定在较高水平。原位杂交结果表明， akt3在2hpf至96hpf的胚胎都有表达，且没有组织特异性。在成鱼中，除鳃部 外，Akt3在所检测的其余组织器官均有表达，在脑部和卵巢表达量较高；与Aktl mRNA。过表达的结果显示，akt3 研究相似的，我们构建并合成了斑马鱼myr-akt3 能使斑马鱼胚胎的发育滞后且伴随着尾部短粗、体节模糊、尾末端膨大甚至严重 缩短等不同程度畸形。而在斑马鱼myr-akt3注射组发育至24hpf时观察，排除 akt3造成的发育延迟后，发现注射过akt3的斑马鱼胚胎的脑部厚度和长度较对 照组显著增大，表明akt3对斑马鱼胚胎脑部尺寸发育有影响。 两者都对脑部发育和尺寸形成有显著影响，而PKBy／Akt3还会引起胚胎的发育 滞缓及尾部的畸形。 关键词：斑马鱼；PKBa／Aktl H四倒；过表达；脑部发育；神经保护 S 中国海洋大学硕士学文论文 ofPKB／Aktinzebrafish Functional analysis early develor：nta’stag,developmentalstages Abstract ProteinkinaseB knownas