PCR技术在禽病诊断中的应用.pdfVIP

2013年度实验室技能培训材料 PCR技术在禽病诊断中的应用 集团技术中心禽病室 2013年8月21 日 主要内容 Ø PCR技术概述 Ø PCR方法操作步骤 Ø PCR的临床诊断应用 Ø PCR常见问题及处理方法 流程树 样品信息登记 病原分离 （接胚 ， 样品前处理 收获尿囊液 ） 核酸抽提 寄回总部保存毒种 PCR反应 总 汇 息 信 琼脂糖凝胶电泳 发送总部序列分析 阳性样品送测序 测序结果返回 一、PCR技术概述 1. PCR 定义 PCR （Polymerase Chain Reaction ）即聚合酶链式 反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特 定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外 复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。 一、PCR技术概述 2. PCR反应过程及原理 变性 94˚C 延伸 退火 72˚C Tm-5˚C PCR原理.wmv 3. PCR的特点 ü高度的灵敏性 PCR产物的生成量是以指数方式增加，能将皮克 -12 -6 （10 ）级的起始待测模板扩增到微克级 （10 ） 水平。病毒检测中，PCR灵敏度可达到3个PFU， 细菌检测中， 最少可检测出3个细菌。 ü特异性强 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果 的关键。 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异 性；同时尽可能减少非特异性扩增。 ü操作简便、快速 利用PCR扩增，只需要2 ～4小时就可以扩增出可用电泳法 检测的DNA，判定检测样品中是否为阳性。 ü检测样品种类多 样品种类 前处理 Axygen 适用范围 试剂盒 血液 分离血清 是 对有病毒血症病毒适 用 如ALV 尿囊液 直接抽提 是 AIV,IBV,MPV,GPV 咽喉及泄殖腔拭子 用双抗溶解震荡30s 是 AIV系列 （5,7,9 ） APV 病料组织 研磨冻融3次，