人乳铁蛋白杀菌机理电化学研究(黄俊逸).docVIP

人乳铁蛋白杀菌机理的电化学研究 *通讯作者，jy-huang@shu.edu.cn，+86-21上海大学生命科学学院 食品营养与功能实验室 上海 宝山 200444 摘要通过技术铁蛋白关键词：乳铁蛋白 抗菌 电化学 乳铁蛋白主要是由乳腺上皮细胞表达和分泌的一种重要的非血红素铁结合糖蛋白，随乳汁而进入到食用者体内发挥其生理功能[1-3]。乳铁蛋白除广泛分布于人和哺乳动物家畜外，还分布于其他多种组织及其分泌液中，包括泪液、精液、胆汁、滑膜液等内、外分泌液和嗜中性粒细胞中。它是由一条多肽链和24条多聚糖侧链组成的分子量约为80 kDa的大分子蛋白[4-6]。乳铁蛋白是转铁蛋白家族成员之一，虽与血清转铁蛋白在化学属性、分子质量、二硫键结构和抗菌特性等方面类似，但二者在氨基酸组成、碳水化合物、抗原性、生物学特性和功能方面存在着很大的差异，因此是两种不同的蛋白质[7]。乳铁蛋白具有广泛的生物学活性，包括广谱抗菌作用、消炎、抑制肿瘤细胞生长及调节机体免疫反应等，被认为是一种新型抗菌、抗癌药物和极具开发潜力的功能食品化妆品和饲料添加剂[8]。目前为止，研究最深入的莫过于它的广谱抗菌作用及其抗菌机理[9]。 1972年，Bullen等[10]首先提出了乳铁蛋白与铁离子结合起到抑菌作用除乳酸杆菌外，铁元素是维持细菌生长所必需的营养因子，乳铁蛋白通过螯合环境中的铁离子，使铁离子浓度保持在细菌生长所需的水平以下，从而达到抑制细菌生长的目的。然而乳铁蛋白通过结合铁离子所表现出的抑菌活性，只能暂时抑制细菌生长，一旦铁离子浓度达到正常生长水平，细菌又能完全恢复生长。Arnold等[11]从人乳中分离出来的乳铁蛋白能完全抑制链球菌突变株和霍乱弧菌的生长，即使补充足够的铁离子也不能恢复良好的生长状态，这一结果说明乳铁蛋白具有直接杀菌的作用。1988年，Ellison等[12]测定乳铁蛋白作用于菌体后释放的脂多糖含量，结果推测乳铁蛋白能引起革兰氏阴性菌细胞外膜的损伤，进而导致整个菌体的死亡。1994年，Appelmelk等[13] 通过酶联免疫吸附法测定乳铁蛋白含量，发现乳铁蛋白可以与革兰氏阴性菌的外膜成分脂多糖结合，证明乳铁蛋白是一种脂多糖结合蛋白。2012年，Maria等[14]在总结前人的基础上，提出了完整的杀菌，即乳铁蛋白通过与革兰氏阴性菌外膜成分脂多糖结合，导致脂多糖的彻底释放，引起细菌细胞外膜通透性的增加，进一步引发了整个菌体的死亡。但是到目前为止，还未见有其他相关报道来进一步直接验证这种杀菌的机理。 由于生物电化学方法具有简单、快速、样品量少以及灵敏度高优点，与方法日臻完善。本实验将生物膜的构建与电化学技术相结合乳铁蛋白的杀菌机理，并对其杀菌的微环境条件进行了探讨现将结果报道如下。 材料和方法 1.1 材料 人乳铁蛋白，大肠杆菌脂多糖（LPS），1,2-二棕榈酰-sn-甘油磷脂酰胆碱（DPPC），均购自Sigma公司；实验所用其他化学试剂为分析纯实验用水经过Milli-Q纯化系统(Barnstead 公司, 美国)纯化至电阻大于18 MΩcm-1. 1.2 膜修饰石墨电极的制备 （1）石墨电极的预处理 电极的预处理参照Huang等[15]具体操作：将石墨电极保持竖直依次在800目、5000目的细刚玉砂纸上打磨，除去吸附在电极表面的杂质，将打磨过的电极用氧化铝粉末（d=0.05μm）与水的混合物在绒布上抛光。将抛光过的电极依次在无水乙醇和超纯水中各超声清洗5分钟，除去吸附在电极表面的氧化铝粉末，将处理好的电极用氮气吹干备用。 （2）石墨电极的修饰 1.3 电化学检测 电化学实验均在CHI660C电化学工作站上完成。实验采用三电极系统，即以热解石墨电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极。本实验所用的电化学检测方法为循环伏安法。将修饰过的石墨电极浸入含100μL 一定pH的乳铁蛋白液中反应30分钟，取出电极，用超纯水清洗电极后进行循环伏安法检测。循环伏安法扫描范围为-0.2 V～0.6 V。扫描速度100 mM/s，所用探针为5 mM Fe(CN)63-/4- ，电解液为0.1 M 磷酸缓冲液（pH 7.4）。所有实验步骤均在室温下进行。 2 结果讨论 2.1 乳铁蛋白的杀菌活性可通过测定乳铁蛋白处理修饰电极前后，在电极表面形成的氧化还原峰电流的变化来判定。从图1中，可以看到在裸电极表面形成了一很的峰，显示出了可逆的电子传递。当电极表面了一层PC+LPS，，这表明了和电极表面的电子传递被这层脂膜了。当修饰PC+LPS的电极乳铁蛋白，采用同样的，了的峰电流。修饰PC+LPS的电极BSA溶液中反应30 min后，采用同样的进行。发现电极峰电流和修饰PC+LPS的电极。乳铁蛋白造成了脂膜的损伤，在脂膜上形成了可以让