冰冻切片制作和染色过程中常见问题和处理.pptVIP

（3）所有切片背景过深 ① 内源性过氧化酶没有完全阻断 ② 切片或涂片过厚 ③ 漂洗不够 ④ 底物呈色反应过久 ⑤ 蛋白质封闭不够或所用血清溶血 ⑥ 使用全血清抗体稀释不够 * （4）阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应。 最常见的原因是： 标本的固定和处理不当 * 最后一个细节：PBS洗液的PH和离子强度 建议PH在7.4-7.6，浓度是0.01M 中性及弱硷性条件（PH=7-8）有利于免疫复合物的形成 酸性条件则有利于分解 低离子强度有利于免疫复合物的形成 高离子强度则有利于分解 * 谢 谢！ * 冰冻切片制作与染色过程中常见的问题 夏春梅 cmxia@fudan.edu.cn * 问题思考 组织是否足够新鲜？1w以内？ 灌注固定液、洗液PH值、离子浓度是否合适？ 一抗是选择途径，滴度如何确定的？ 是否阅读过DATASHEET? 保存，有效期，reactivity, Cross-Reactivity ？ 对该蛋白表达和分布有无预期的估计和了解? 是否设了阳性和阴性对照？ 是否排除了自发荧光？ 是不是判读正确？ * 一、冰冻切片的优缺点 优点： 简便，快速，用时短 可以不需要对组织固定、脱水、透明、包埋 组织变化不大 能很好保存脂肪，类脂 能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类 对有机溶剂或热的温度耐受能力较差的细胞膜表面抗原和水解酶保存较好。 缺点： 不容易做连续切片 组织不能过大-不容易冻结或者组织冻结不均 不容易制作较薄的切片 冻结过程中容易产生水的结晶而影响细胞的形态结构及抗原物质的定位 组织结构不如石蜡切片清晰，但是满足科研的要求 针对其缺点要注意操作条件优化，避免错误 * 二、切片制作过程中几个关键步骤 1. 动物取材 2. 组织固定 3. 切片制作 4. 切片染色 好的切片制作和染色成功的关键 细节决定成败 固定、漂洗溶液PH值，成分；切片厚度、手感；抗体效价、特异性；切片孵育时间，湿度、温度； 切片判读正确-反映真实的科学现象 知识结构背景 组织学结构的熟悉…… 认识病理改变：炎细胞侵润、坏死、水肿、蛋白变性、纤维化、增生、凋亡…… 审美观、拍照角度、视野、曝光时间、对比度…… * 常规HE染色 特殊染色 如：Masson(Thichrome staining)，油红O，尼氏染色，台盼蓝（肥大细胞）染色 免疫染色(immunol staining) 免疫荧光(immunol fluorescence) 免疫组化(immunol histochemistry) 依据科学研究的需要选择方法 * 1. 动物取材：一定要注意“平行性” 1 Control 6 Control 2 Control 3 Control 4 Control 5 Control 1 sham 6 sham 2 sham 3 sham 4 sham 5 sham 1 I/R 6 I/R 2 I/R 3 I/R 4 I/R 5 I/R 1 I/R+treatment 2 I/R+treatment 3 I/R+treatment 4 I/R+treatment 5 I/R+treatment 6 I/R+treatment 预实验时早发现趋势而不被误导，减少无效率的工作量 减少不同组间baseline的影响，便于不同批次实验组间比较（背景，抗体效价，环境条件对染色影响） 发表、修改文章图的一致性 横向 纵向 横向“block” * 举例：不同实验时间和条件下同种一染色方法结果差异 A B C Masson staining * 2. 标本固定应充分 固定的标准 切片冰晶少，细胞挤压变形小，切片完整，染色清晰 一般较多采用组织固定后再行切片 浸入法和灌注法 浸入法：活检、手术标本，不能进行灌注的组织固定 灌注法：动物实验研究 固定剂种类：醛类、非醛类、丙酮及醇类 中性缓冲液配制多种聚甲醛较为常用 组织固定时 固定液要有足够的量(固定液是组织体积的8-10倍) 保持一定时间，快速灌注固定后，相同的固定剂再固定2-4h（ 4℃冰箱） * 减少冰晶的形成 公认：未经固定的组织切片冰晶较多 固定后的组织切片仍然会有一定的冰晶，为防止冰晶的形成 采取如下方法 速冻法：将组织置入低温环境，使组织骤然降温 利用高渗溶液吸收组织水分子：将组织置于20% —30%的蔗糖溶液中，置4摄氏度冰箱足够时间（多长时间? 判定？） * 3. 切片：组织新鲜非陈旧标本是成败首要因素 低温恒冷箱冰冻切片法 组织快速冷冻到一定的硬度(机器要预冷) 选择不同的冷冻度 根据不