分子生物学第五章分子生物学的常规技术(四)snp及其应用.ppt

Single nucleotide polymorphism SNP的特征 SNP是人类可遗传的变异中最常出现的一种，占所有已知多态性的90%以上，在人类基因组中广泛存在，人类DNA中每300-1000bp就有一个SNP. 因此，一个人类个体大约携带300万-1000万个SNPs。 SNP的特征 一个SNP表示在基因组某个位点上一个核苷酸的变化， 作为一种碱基的替换，大多数为转换（C—T，G—A），也可能是颠换。 具有转换型变异的SNP约占SNP总量的2／3左右。 转换的发生率总是明显高于其它几种变异，而且在CG序列上出现最为频繁，多是发生C—T的转换，原因是CG中的C是甲基化的，它能自发的脱氨基而替换为胸腺嘧啶。 SNP大都表现为二等位基因（bialletic)多态性,即在该位置只存在两种不同的碱基。 位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点被称作单倍型(haplotype)，相邻SNPs的等位位点倾向于以一个整体遗传给后代. 根据SNP在基因组中的分布位置可分为: 基因编码区SNP(cSNP) 基因调控区SNP(pSNP) 基因间随机编码区SNP(rSNP) 等三类。 因为编码区内的变异率占周围序列的1/5，cRNP的总量显著少于其他两类SNPs。 cSNP又可分为2种： 同义cSNP(synonymous cSNP)： 非同义cSNP(non-synonymous cSNP) 同义cSNP： SNP所导致的编码序列改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同； 非同义cSNP： 指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响蛋白质的功能。这种改变常常是导致生物性状改变的直接原因。 位于基因调控区的SNP则会影响基因表达量的多少，因此，这两类SNP在功能和疾病发生发展方面具有更重要的意义。 焦磷酸测序法 焦磷酸测序法(pyrosequencing)是一种不依赖平板胶或毛细管电泳，不依赖DNA的荧光标记/激发/检测体系的序列分析技术，适用于已知序列的DNA片段进行验证分析，适用于已知SNP的序列验证及基因分型。 焦磷酸测序法主要是由四种酶催化同一反应体系中的酶级联反应: 包括DNA聚合酶、硫酸化酶、萤光素酶和双磷酸酶; 反应底物为adenosine 5‘phosphosulfate(APS)和萤光素。 反应体系还包括待测序的DNA单链和测序引物。 在每一轮测序反应中，加入一种dNTP。 如该dNTP与模板配对，聚合酶就可以催化该dNTP掺入到引物链中并释放焦磷酸基团(PPi)。 掺入的dNTP和释放的焦磷酸的物质的量相等，反应时dATP由deoxyadenosine alfa-thio triphosphale(dATPaS)替代． 因为DNA聚合酶对dATPaS的催化效率比对dATP的催化效率高，且dATP是萤光素酶的底物，dATPctS不是。 硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，其物质的量和焦磷酸一致。 ATP驱动萤光素酶介导的萤光素向氧化萤光素(oxyluclferin)的转化，氧化萤光素发出与ATP含量成正比的可见光信号。 光信号由CCD摄像机检测并通过相应的软件得到反映。 每个峰的高度(光信号）与反应中掺入的核苷酸数成正比，ATP和未掺入的dNTP由双磷酸酶降解，猝灭光信号，并再生反应体系，加入另一种dNTP进行下一轮反应。随着以上过程的循环进行，互补DNA链合成，DNA序列信号峰确定。 该技术分析系统自动化程度高，通量大，速度快，易于建立标准化操作，适合大规模SNP研究及基因分型。 1．人类基因单体型图的绘制 大多数染色体区域具有少数几个常见的单体型，代表了一个群体中人与人之间的大部分多态性。 某些染色体区域可以有很多SNP位点，但是只用少数几个标签SNPs，就能够提供该区域内大多数的遗传多态性模式。 绘制人类基因单体型图的目的就是描述人类常见的遗传多态性模式和染色体上具有成组紧密关联SNPs的区域。 2002年10月，国际人类基因组单体型图计划(HapMap计划)正式启动，截至目前已有超过150万SNPs被精确定位于各染色体上，并且已根据这些SNPs对来自4个不同人种的269份DNA样品进行了基因分型。 后期目标是要使总密度达到每500bP有一个SNP。通过不同个体基因组DNA的基因分型和频率计算，绘制更加