EphA7在原发性肝细胞癌中地表达与其体外抑制的研究.pdf

EphA7在原发性肝细胞癌中的表达及其体外抑制研究 目的 ． 观察EphA7基因和蛋白在原发性肝细胞癌中的表达，分析EphA7的表达与 肝癌临床病理特征的关系并探讨其临床意义。 方法 收集40例肝癌组织及其相应的癌旁肝组织和10例正常肝脏组织标本。40 实时荧光定量PCR、免疫组织化学和Westernblot方法检测上述标本中EphA7 基因和蛋白的表达情况，并分析其于原发性肝癌临床病理因素的关系。 馇里 ；口木 1．40例肝癌组织及相应的癌旁肝组织和10例正常肝脏组织中均有EphA7 组织和正常肝组织中EphA7基因的表达差异无统计学意义(卢0．998)。 mRNA的表达与肝癌患者的年龄、肿瘤大小、临床分期和甲胎蛋白 2．EphA7 水平等各项临床病理指标均无关(PO．05)，而与肿瘤的分化程度、门静脉癌 mRNA的表达明 栓和淋巴结转移有关(PO．05)。分化程度低的肝癌患者EphA7 mRNA表达明显高 显高于分化程度高者(户O．030)，有门静脉癌栓的患者EphA7 mRNA表达明显高于无淋 于无门静脉癌栓者(户0．017)，有淋巴结转移者EphA7 巴结转移者(P=O．013)。 3．EphA7蛋白的阳性表达主要定位于肝细胞和肝癌细胞的胞浆，以及纤维 间隔内血管壁的内皮细胞。其中肝癌细胞中EphA7蛋白的阳性表达较强，染色 较深。癌旁肝组织及正常肝脏组织虽也可见到EphA7蛋白的阳性表达，但颜色 普遍较浅。Westernblot分析发现EphA7蛋白在肝癌组织、癌旁肝组织和正常 织(户0．001)和正常肝组织(P：-O．003)，而在癌旁肝组织和正常肝组织中的其 表达差异无统计学意义(户0．309)。 III EphA7在原发性肝细胞癌中的表达及其体外抑制研究 4．肝癌组织中EphA7蛋白的表达与肝癌患者的年龄、肿瘤大小、临床分期 等临床病理指标均无关(P0．05)，而与肿瘤的分化程度、有门静脉癌栓、淋 明显高于无门静脉癌栓者(P=O．008)，有淋巴结转移者EphA7蛋白的表达明显 水平低者(P=-O．013) 结论 EphA7不仅参与了正常肝脏细胞的生长发育过程，还与肝脏细胞的恶性转 化密切相关。其可能在肝癌的恶性转化、侵袭和转移等生物学行为中发挥重要 作用。 i 第二部分pRNA-sEphA7千扰表达载体的构建与鉴定 目的 成功构建针对酪氨酸蛋白激酶受体EphA7基因的RNA干扰真核表达载体 pRNA—siEphA7。 方法 末端均加上与质粒载体pRNA-U6．1／Neo对应的酶切识别位点及转录终止子，人 工合成针对EphA7的发夹样结构siRNA互补双链寡核苷酸。经过退火、质粒线 性化以及体外重组等过程，构建抑制EphA7基因表达的干扰载体 Q后进行克隆 pRNA—siEphA7一l、2和3。将干扰载体转染入感受态大肠杆菌DH5 和筛选，PCR鉴定及基因测序验证干扰载体的准确性。 复士蟹 ；日7K 1．新合成的正义及反义寡核苷酸，经退火处理形成双链互补结构。经DNA 片段纯化及回收后，在1．5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，在UVP凝胶成像分析仪 IV 上对照Marker 118bp相吻合。 2．以空载 扩增筛选鉴定 pRNA-U6．1／Neo载体。 3．对3个重组质粒进行测序，结果证实插入的寡核苷酸序列正确，进一步 证实重组质粒成功构建。 结论 筛选及鉴定，证实其插入的寡核苷酸序列正确，进一步验证了其准确性并证实 干扰载体pRNA—siEphA7构