01第一章生物大分子物质的制备pptConvertor.docVIP

第一章 生命大分子物质的制备 第一节 材料的选择与处理 第二节 确立测定方法 第三节 细胞的破碎 第四节 抽 提 第五节 浓 缩 第六节 纯化方案的设计与评价 第七节 有效成分纯度和性质的分析 第八节 应用实例 生命大分子物质通常是指： 动物、植物和微生物在进行新陈代谢时所产生的蛋白质(包括酶)和核酸等有机化合物的总称。 生命科学研究将进入后基因组时代。分离纯化和测试分析蛋白质技术显得十分重要。 本章将以蛋白质和核酸为主线讨论其制备的一般过程，即材料的选择与处理、测定方法的确立、有效成分的抽提、粗品的纯化和纯品的鉴定(这部分移至后面的章节介绍)等步骤。 第一节 材料的选择与处理 一、材料的选择 A.有效成分 是指欲纯化的某种单一的生命大分子物质。而有效成分以外的其他物质则统称杂质。 B.有效成分在材料中存在的特点 有效成分的含量一般较少 如胰脏中胰岛素的含量小于其鲜重的百万分之一。 有效成分稳定性较差 大多数对酸、碱、高温和高浓度有机溶剂等因子较敏感，易被微生物分解变质。 选用的材料不同，有效成分的含量就不同； 选用的材料即使相同，但是部位或生长期不同，有效成分的含量也不尽相同。 C.材料选择应遵循的原则 有效成分含量多、稳定性好 来源丰富、保持新鲜 提取工艺简单 有综合利用价值等 二、材料的处理 选择到合适的材料后，应及时使用，或采用冰冻或干燥等方法处理。 同时还应将易于去掉的非需物质除去。 1 动物脏器 (1)冰冻 应在很短时间内置-10℃冰库(可短期保存)或-70℃低温冰箱(数月不变质)贮存。 脱脂 脂肪容易氧化酸败，导致原料变质，而且还会影响纯化操作和制品得率。 一般脱脂的方法有： A.人工剥去脏器外的脂肪组织； B.浸泡在脂溶性的有机溶剂(如丙酮、乙醚)中脱脂； C.采用快速加热(50℃左右)、快速冷却的方法，使熔化的油滴冷却后凝聚成油块而被除去； D.利用油脂分离器使油脂与水溶液得以分离。 (2)干燥 A.丙酮液中脱水，干燥后磨粉贮存备用； B.在沸水中蒸煮处理，烘干后能长期保存。 2 植物组织 A.叶片 用水洗净即可使用； 或在l0h内置-4～-30℃冰箱贮藏备用。 B.植物种子 需泡胀或粉碎才可使用。 材料含油脂较多时，要进行脱脂处理。 3 微生物 为制备生命大分子物质的主要材料之一。 用离心法收集到的上清液， 可用于制备胞外酶和某些辅基等有效成分； 可置低温下短时间贮存。 收集到的菌体，经破细胞处理后则可从中提取其他有效成分； 或制成冻干粉，在4℃保存(数月不会变质)。 第二节 确立测定方法 一、目的与要求 测定哪些材料含有目标有效成分？ 哪些材料含量丰富？ 提纯过程纯度是否逐渐增加？ 要确立专一、准确、灵敏和简便的测定方法。 因为：有效成分在原材料中含量较低；底物要专一性的。 二、常用的测定方法 1.光谱法 2.电化学法 3.生物活性检测法 4.免疫分析法 5.生物传感器 1 光谱法 (1)吸收光谱法[①直接测定法；②比色法] (2)荧光法 (3)浊度法 特点： 测定时所需的样品量较少，但往往能产生比较高的消光值； 且操作简单，反应迅速、灵敏； 结果也较准确， (1)吸收光谱法 直接测定法、比色法 ①直接测定法 将待测物(如核酸、蛋白质)配制成一定浓度的溶液后，移至相应波长的分光光度计中， 即可从测定的消光值换算出待测物的含量。 A.测定核酸含量 构成核酸的碱基组分是分光光度计测定核酸含量的依据。 在测定过程中，DNA或RNA溶液浓度的增加或降低，会使其在波长260nm的消光值(A260) 随之增加或降低，二者之间成正比关系。 通常1个A260值分别相当于 双链DNA 50μg／ml 单链DNA 37μg／ml 单链RNA 40μg／ml 用A260／A280比值可确定DNA和RNA的纯度： 纯DNA比值为1.8 纯RNA的比值为2.0 当此比值分别小于1.8和2.0时，表明样品中已污染了蛋白质或酚类等物质。 B.测定蛋白质的含量及纯度 蛋白质(包括酶和肽)溶液的A280值主要是由构成蛋白质组分的色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)的消光值决定的，胱氨酸的贡献很小。 ②比色法 将待测物(如蛋白质、核酸、糖类)与相关试剂(见表1-2)或酶的底物作用后，根据呈现的颜色或