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MRGx1基因的原核表达及蛋白检测
海南大学农学院09级生物科学专业 许连华 20090110310061
MRGx1基因的原核表达及蛋白检测
一 实验目的
1、了解并掌握PCR、DNA连接、感受态制备及转化操作,学习载体构建、原核表达及蛋白检测。
2、通过完整综合实验的操作和学习,提高对专业理论知识的认知,达到培养思考能力的目的。
二 实验原理
原核表达一般程序是,宿主菌(受体菌)感受态的制备与转化,获得目的基因,准备表达载体,将目的基因方向正确地插入到表达载体中,转化表达宿主菌,测序验证后诱导靶蛋白表达,最后对表达蛋白进行制备、纯化和功能分析。本实验流程是通过PCR扩增出MRGx1基因目的片段,与T-载体连接,转化入DH5ɑ,得到高拷贝目的基因,再经过双酶切与pET30ɑ质粒载体连接,转化入BL21,使外源基因得到表达,最后进行蛋白检测。
感受态是指宿主,本实验为大肠杆菌,最易接受外源DNA片段并能实现其转化的一种生理状态,Ca2+能有效的促进转化作用。转化在基因克隆技术中特指将外源质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA引入受体菌体内,使之获得新的遗传特性的一种手段。感受态制备有电击法和热击法。热击法也叫Cacl2法。其原理是细菌菌体在Cacl2低渗溶液中膨胀成球状,转化混合中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面而利于细胞吸收。
目的基因的获得是利用PCR技术对已知基因,本实验为MRGx1基因的扩增获而获取。PCR扩增是指在适宜条件下,DNA聚合酶以单链DNA为模板利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸(dNTP),在引物的引导下按5′→3′方向复制互补DNA。经过热变性→复性→延伸,n个循环后可得到2nDNA。基因片段PCR产物的回收有多种方法,如电泳法、机械破碎法、回收试剂盒等。本实验采用DNA凝胶回收试剂盒。
载体是能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。质粒是基因工程中常用的载体之一。为闭合的双链环状DNA分子,存在于染色体外的能自主复制的稳定遗传物质。制备质粒DNA载体的方法有煮沸法、SDS法和碱裂解法。本实用采用的是碱裂解法。任何破坏维持DNA双螺旋结构的氢键和疏水作用力的因素都可引起DNA的变性,如高温、有机溶剂等。在高碱环境中线性的大分子量染色体DNA双螺旋分子开链变性,而共价闭合的质粒DNA由于互补双链的彼此盘绕仍会保持紧密结合。将PH调至中性并形成高盐浓度环境,质粒DNA快速复性恢复至超螺旋状态溶于体系,而染色体DNA不能有效复性而相互交联形成不溶网状结构,与蛋白质一起在去污剂SDS的作用下形成沉淀离心去除。本实验用的是T-载体和pET30ɑ质粒载体。
DNA重组是将目的DNA片段与合适载体相连接构建新的DAN分子。先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段,经分离纯化后,通过连接酶将二者连接,构建重组质粒,在经细菌转化,获得具有重组质粒的重组菌株。本实验采用的是T载体连接和pET30ɑ质粒载体。T载体连接是利用PCR时Taq酶作用产生的多聚A尾。重组后的DNA分子先转到DH5ɑ,再转到BL21。因为在DH5ɑ中可稳定复制,用于重组DNA的大量扩增;而BL21为蛋白酶缺陷型,保证表达的蛋白不被降解,用于产物的表达。另外,T-载体为复制型载体,能将外源基因大量扩增。而pET30ɑ质粒载体为表达型,表达外源基因。
重组DNA的表达系统可分为原核表达系统和真核表达系统。本实验的是大肠杆菌原核表达系统,用IPTG诱导外源基因表达。当培养基含有IPTG时,Lac启动子被诱导启动下游插入基因的表达,从而产生外源基因产物。用蓝白斑筛选挑选阳性克隆株,通过电泳检测,即可检测到蛋白是否表达及表达产率。本实验采用SDS蛋白质电泳检测蛋白。具有分子筛效应,使蛋白的有效迁移率和蛋白的分子量大小有关。
三 实验器材与试剂(略)
-80℃冰箱、LB固定平板、大肠杆菌、LB培养液、分光光度计、离心管、吸水纸、离心机、MgCl2-Cacl2溶液、Cacl2、甘油、10x Buffer、dNTP、引物、Taq酶ddH2O、PCR仪、电泳仪、吸附柱、漂洗液、洗脱液、预先购买的T-载体、溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、氯仿/异戊醇、无水乙醇、TE溶液、氨苄青霉素抗性平板、双酶切体系、卡那霉素
四 实验操作
(一)大肠杆菌感受态细胞的制备及检测
1、-80℃冰箱取出保存菌液,LB固定平板划线培养12h。
2、挑取单菌落接种于5mlLB液体中,37℃ 220rpm振荡培养过夜。
3、取培养物按1:100接种于新鲜LB培养基中,37℃ 220rpm培养2-3h至OD600为0.4-0.5
4、菌液置于冰上放置10min,使培养物冷却至0℃,转入预冷离心管。
5、4℃ 3000g离心8min,沉淀菌体。弃上清,吸水纸上倒置30″
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