对虾抗病微生物地筛选与其作用机制地的研究.pdf

对虾抗病微生物的筛选及其作用机制的研究 捅要 益生菌是公认的安全有效的对虾免疫增强物质，同时也是控制对虾病害的 主要策略之一，目前欠缺的是对新型高效的功能性菌株的筛选和应用研究。本 研究是以分离自健康对虾消化道和养殖环境的几株优势菌为研究对象，在考察 它们抗WSSV感染效果的基础上，进一步分析了坚强芽孢杆菌PC024和溶藻胶 弧菌LV463添加到对虾饲料中，对养殖对虾免疫酶活性、免疫相关分子表达水 平以及对WSSV在对虾体内的增殖速率的影响。本研究取得了坚强芽孢杆菌活 菌与溶藻弧菌活苗配合使用可显著提高凡纳滨对虾抗WSSV感染的能力；抗病 菌株通过提高对虾免疰水平和抗病基因表达来减缓病毒在对虾体内的增殖，从 而发挥抗病毒保护作用等重要结果。本研究筛选的菌株可望以饲料添加剂的方 式应用于对虾养殖生产，成为对虾白斑病生态防治的有效途径之一。主要研究 内容和结果分以下几方面： 1、海水细菌主要鉴定方法的应用与比较。为了寻求快速准确地鉴定细菌的方法， 本实验同时采用16SrRNA基因序列分析法、细菌脂肪酸气相色谱法、ATB微生 物鉴定系统、Biolog微生物自动鉴定系统4种方法对分离自健康对虾肠道和养殖 海水的i6株海水细菌进行鉴定。结果显示：16SrRNA序列分析和细菌脂肪酸气 rRNA序列分 相色谱法比ATB法和Biolog法鉴定步骤简单．且鉴定成本低；16S 析和ATB法鉴定到种的准确率远高于Biolog法和细菌脂肪酸气相色谱法。在具 体的实践中可根据实验要求和设备条件选择合适的细菌鉴定方法，也可以将不同 的方法结合起来得到更加准确的鉴定结果。 2、一株海水芽孢杆菌的鉴定与生物学特性分析。从健康中国对虾养殖海水中分 离纯化一株优势菌，编号为PC924，形态学观察和革兰氏染色说明该菌株为革兰 氏阳性菌，2216E培养基培养24h的菌落呈圆形、中间略微凸起，直径约为2mm， 细胞呈杆状，端生芽孢，周生鞭毛。经Biolog碳源利用反应、脂肪酸气柑色谱分 析得出该苗株与坚强芽孢杆菌的生理生化特性最相近；16SrRNA序列测定表明 与芽拖杆菌属中几株苗的同源性均达到100％咀上，在分子进化树中该菌株与坚 rRNA基因序列分析、 强芽孢杆菌(Bacilhufirmus)的进化地位最接近。综合16S ATB微生物自动鉴定系统、BIOLOG微生物自动鉴定系统和细菌脂肪酸气相色谱 四种方法的鉴定结果，将该菌株鉴定为坚强芽孢杆菌。 3、4株共生菌单一或复合菌株对凡纳滨对虾抗WSSV感染力的影响。将坚强芽 vftHH口mei)的养殖， 一或组合后分别包裹于饲料中应用到凡纳滨对虾(￡itopenaeus d后统计每个实验组的累积 投喂20d后．用WSSV进行肌肉注射攻毒，感染14 死亡率。从感染实验结果看出：坚强芽孢杆菌／溶藻弧菌复合组(B／V组)的累 积死亡率显著低于其他各实验组和对照组(P0 05)。饲喂含有坚强芽孢杆菌、蜡 样芽孢杆苗、两株溶藻弧菌的饲料均可显著提高凡纳滨对虾抗wssv感染的能 力，且坚强芽孢杆菌与溶藻弧菌配台使用的效果最佳。 4、饲料中添加益生菌对凡纳滨对虾免疫相关酶活性的影响。以两种实验饲料(芽 孢杆菌单一菌组、芽孢杆菌／灭活溶藻弧菌组)和基础饲料，对凡纳滨对虾进行 了为期35d的养殖实验。养殖期间每5d取样，分析益生菌对对虾血清和肝胰腺主 要免疫酶活性的影响。结果显示：免疫期间和感染WSSV期间各实验组对虾血清 和肝胰腺的酸性磷酸酶活性(ACP)、总超氧化物歧化酶(SOD)、溶苗酶(LZM)、 过氧化氢酶(POD)、酚氧化酶(PO)等相关免疫酶活性和蛋白含量较对照组 显著增加(p005)，结果提示：益生菌的补充可增强对虾免菠功能，从而提高 对虾抗WSSV感染的能力。 5、饲料中添加益生菌对凡纳滨对虾血淋巴免疫相关分子表达水平的影响。饲料 的制备与对虾的养殖同第3章，养殖期问每5d取样，分析益生菌对对虾血淋巴酚 影响。Real．timePCR的结果显示