碱性成纤维细胞生长因子对血管内皮细胞迁移地影响与其与粘着斑激酶地关系.pdf

取培养好的ECV--304，在培养瓶底的外面绘出如图l所示的标记线。 4．细胞划痕 沿着瓶外的标记，采用上述细胞刮刀在瓶内对细胞进行划痕损伤，每瓶划 痕一次，要求划痕直，宽度和长度控制在lx50mm左右． 5．洗净刮掉的细胞 用无血清培养液轻轻吹打划痕附近，倒掉培养液。反复3次，尽量将刮掉 的细胞冲洗干净。继续细胞培养。每瓶加入6ml无血清RPMl640培养液；培 培养。 6．细胞迁移的测定 将细胞培养瓶放在10x5倍的倒置电视显微镜下，图象经电视摄象进入监 视器屏幕，通过监视器屏幕上的“窗口”作定量测定。“窗口”大小为50mm (20ram。将“窗口”一端放在底线划痕两侧边缘的中点垂直线上。在“窗口” 中描出细胞划痕(或迁移)的边缘(图1)，然后经电脑自动计量转换，测算 以下二个指标： 细胞迁移区域 窗口：A+B A己迁移的细胞 B无细胞的空白区 C、E：为划疫处的底线 D；底线的中点 ●———■ ：迁移距离 图中双条线为培养瓶外壁上人工 画出的标记线 图1 电视监视器屏幕上细胞迁移测量示意图 1)迁移速度(migrationspeed)：测量划痕(或迁移)两侧内皮细胞间 的距离(um)的变化，用迁移距离反映迁移速度。从电视屏幕上培养瓶标记的 底线(cE处)开始，沿划痕边缘标记线每隔5cm(相当于培养瓶上实际距离 0．33 mnO测一数据(图上．-的长度)，结果用Oh划痕边沿的距离减掉各 时间点迁移边沿的距离来表示． 盖区，用软件测得的A区面积占(A+8)面积的百分数，经计算机自动换算出迁 移面积。测量时窗口置于中线左右各三次。 三．统计学处理 全部实验数据均采用x±S表示，差异的显著性用组间t检验。有关指 标之间的相关关系用直线回归相关分析．全部统计资科均用SPSS电脑软件进 行分析。P≤0．05为差别有显著意义。 实验结果 1．划痕损伤的宽度与长度：用于正式测量研究的ECV--304细胞培养(n =120)中，划疫宽度经电视电脑测量平均值为0．95±0．08mm，划痕长度平均值 为51．20土3．4ll帆。120次模型中．划痕的宽度与长度变化率在5％以内。 2．划痕损伤区完全修复时间：按实验设计，于模型制作后12h、24h、36h、 48h及72h连续动态观察划痕损伤区完全修复时间即划痕损伤区重新被迁移的细 胞完全覆盖的时间。完全覆盖的标准为划痕损伤区两侧向中央迁移的血管内皮细 胞有95％以上已经融合。结果48h观察时无一例完全覆盖， 72h观察时t00 ％完全覆盖，划痕即刻与划痕后培养24小时后的ECV--304细胞见图2。 A：0h B： 24h 图2 划痕损伤模型中迁移的血管内皮细胞(200x) 3．划痕损伤模型中ECV--304细胞迁移速度、面积的变化：各时问点的动 态变化见表l。坌ll|胞迁移速度在培养12h-24h到达高峰，辽移叫钗击¨在24h到 48h间增加迅速。 表1划痕损伤模型中ECV-304细胞迁移的动态变化 司 、 指标 Oh 12h 36h