第三章细胞原代培养(4课时).pptVIP

本章主要内容 无菌培养基本技术 原代培养 （Primary culture）基本技术 细胞原代培养的维持和首次传代 原代细胞的纯化和克隆 二、原代培养 Primary culture 含义:包含①原代培养实质是初次培养，即培养物接种到培养器皿中就不再分割，任其生长繁殖；②原代培养中的“代”并不是指细胞繁殖的“代”数；③原代培养过程中不分割培养物不等于不更换培养液。 特点 (1)性质 ①性状似体内，可表达某些形态、结构、功能, 更能代表活体细胞最接近在体时的情况； ②细胞异质性细胞成分混杂，除目的细胞之外， 其它各种细胞还存在； ③细胞活跃移动，分裂不旺盛； ④相互依赖性强，独立生存能力差,不易单个培 养。 特点 (2)发展过程:调整组成 原代培养的产生- -选择 结果:形成相对均一的细胞系 选择第一步:形成原代培养的基础 组织块:能迁移出的细胞 消化分散:操作中能生存、附着，能悬浮生 存。 特点-发展过程 选择第二步: 时间：数小时后至铺满 (汇合confluence) 变化：数小时后至进一步选择中 3种情况:能增殖 能存活 不能存活 细胞类型继续改变,至铺满 特点-发展过程 选择第三步: 时间：铺满后  (可用于生长区域已被利用) 变化：通过密度抑制 密度依赖性敏感的细胞(如正常细胞)----- 密度依赖性敏感低的细胞(如永生性细胞)--- 特点-发展过程 需及时传代传不传代及何时传代 根据： 接种的细胞数量 培养瓶皿的大小 培养条件 在一定程度上具有可人为操作的特征 根据细胞生长的恃点，传代方法有3种： 悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 半悬浮生长细胞传代（293细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。 细胞消化的最佳程度 细 胞 消 化 过 程 镜 下 观 察 皮肤和粘膜的取材 主要取自于手术过程中的皮片，方法似外科取断层皮片手术操作，但面积一般2－4平方厘米。 内脏和实体瘤的取材 内脏除消化道外基本是无菌的，但取材时要明确和熟悉所需组织的类型和部位，实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，要避开破溃、坏死液化部分，以防污染，尽量去除混杂的结缔组织。 血液细胞的取材 血细胞、淋巴细胞的取材，一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中（如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等）分离细胞，取材时应注意抗凝。 骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材 严格无菌，注意抗凝，还要尽快分离培养，离心后，用无钙、镁PBS洗两次，再用培养液洗一次后即可培养，不宜低温存放。 动物组织取材 ①鼠胚组织取材 首先用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物，然后将其整个浸泡在含有75%酒精的烧杯中，5分钟后（注意时间不能太长，以避免酒精从口或其他通道进入体内，影响组织活力），取出动物，在消毒过的木板上可用无菌的图钉或大头针固定四肢，切开皮肤，用无菌操作法解剖取胚或用无菌止血钳挟起皮肤、用无菌眼科剪沿躯干中部环形剪开皮肤，用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾，把动物反包，暴露躯干，然后再固定，更换无菌解剖器材，采用无菌操作法解剖取出胚胎。 鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材步骤 取孵化至适当胚龄（9~12天）的胚蛋，用照蛋灯在暗处灯检，若有丰富血管、胚体有运动的胚蛋，说明胚体发育良好，并用有色笔划出气室和胚体位置。 将胚蛋置于蛋架上，先用温水清洗蛋壳，再用75%酒精棉球擦干； 经碘酒、75%酒精消毒后，在无菌条件下采用无菌法用剪刀或中号镊子打开气室，沿气室边缘去除蛋壳； 用眼科镊撕去壳膜，暴露出鸡胚； 用弯头镊轻挑起胚头，取出胚胎，放入无菌平皿中，解剖取材。 3. 原代细胞的分离和制作 人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来。 (1)悬浮细胞的分离方法 ?组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟。经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。 (2)实体