大肠杆菌生长曲线实验报告-xiang-renew-edition.docxVIP

E.coli growth curve measurement一、目的1、瞭解細菌生長曲線特徵，測定細菌繁殖的代時；2、學習液體培養基的配製以及接種方法；3、反復練習無菌操作技術；4、瞭解不同細菌，不同接種方法在同一培養基上生長速度的不同；5、掌握利用細菌懸液混濁度間接測定細菌生長的方法6、複習光電比濁法測量細菌數量的方法7、學習平板塗布技術二、原理1、大腸桿菌生長：將一定量的細菌接種在液體培養基內，在一定條件下培養，可觀察到細菌的生長繁殖有一定的規律性，如以細菌的活菌數的對數log10作縱坐標，以培養時間作橫坐標，可繪成一條曲線，成為生長曲線（如圖一）。圖一微生物生長曲線示意圖單細胞微生物的發酵具有四個階段，即Ⅰlag phase調整期（延滯期）：after inoculation cells are becoming acclimated to the new environment( temp, nutrients, etc.)Ⅱlogarithmic phase對數期（生長旺盛期）：cells have adapted and dividing at a constant rate(i.e. the maximum for the species under the given conditions of temp, pH, nutrients, oxygen, etc.)Ⅲ stationary phase平衡期（穩定期）：cell growth ceases as nutrients are exhausted and/or waste products build up in the mediaⅣ death phase死亡期（衰亡期）：number of viable(living cells) in the stationary phase culture decreases(usually due to toxicity of waste products)生長曲線可表示細菌從開始生長到死亡的全過程的動態。不同的微生物有不同的生長曲線，同一種微生物在不同的培養條件下，其生長曲線也不一樣。因此，測定微生物的生長曲線對於瞭解和掌握微生物的生長規律是很有幫助的。測定微生物生長曲線的方法很多，有血球計數板法、平板菌落計數法、稱重法和比濁法等。本實驗採用比濁法測定，由於細菌懸液的濃度與混濁度成正比，因此，可利用分光光度計測定細菌懸液的光密度來推知菌液的濃度。將所測得的光密度值（OD600）與其對應的培養時間作圖，即可繪出該菌在一定條件下的生長曲線。注意，由於光密度表示的是培養液中的總菌數，包括活菌與死菌，因此所測定的生長曲線的衰亡期不明顯。2、平板塗布技術：塗布法接種是一種常用的接種方法，不僅可以用於計算活菌數，還可以利用其在平板表面生長形成菌苔的特點用於檢測化學因素對微生物的抑殺效應。　　　原理:將一定濃度，一定量的待分離菌懸液加到已凝固的培養基平板上，再用塗布棒快速地將其均勻塗布，使長出單菌落或菌苔而達到分離或計數的目的。　　其目的:用於目的微生物的分離；用於藥物的抑菌試驗；觀察菌苔的形狀和特點。　　優點：可以計數，可以觀察菌落特徵，還可以進行菌種的分離。　　缺點：接種前需梯度稀釋，吸收量較少，較麻煩，平板不乾燥效果不好，容易蔓延。三、材料、藥品1、實驗材料：細菌（E.coli）2、培養基：LB?medium；3、實驗儀器：光電比色計、L型玻棒、接種環、超淨工作臺、恒溫培養箱；四、步驟1、取100μLE.coli放入含有200mL LB liquid medium的錐形瓶中，並搖晃均勻。2、取mixed的菌液1mL到cuvette內，拿去測量吸光值，並記錄測得的數值。3、取500μL的菌液放入LB solid medium內，並用玻璃棒塗抹均勻，放入37℃,150rpm的incubator內培養。4、整個實驗共進行24個小時又50分鐘，第三個小時開始用n=600nm測定細菌培養液吸光度，以後每隔一小時測一次，知道實驗結束。（若吸光值大於0.7，則代表菌液的濃度太濃，需要加以稀釋。）5、除第二盤plate相距第一盤plate1小時和第三盤plate相距第二盤plate3小時之外，之後每相隔5小時就要再新畫一盤新的plate。（第一、二盤plate沒有稀釋，第三盤plate稀釋1000X，第四、五、六盤稀釋106 X）五、實驗結果實驗數據時間Time(minutes)A600Log10A600Log2A600菌落數（個/0.1mL）17:200　　　　19:101100.019-1.7212464-5.717856888020:151750.018-1.7447275-5.795859349421:122320.02