骨骼肌的原代培养法.docVIP

骨骼肌的原代培养 试剂 包被用多聚赖氨酸poly-lysine的配制与包被 准备0.94%硼酸溶液 称取0.94硼酸粉末溶于80ml水中，用NaOH将pH值调至8.4，再定容。 按每4.9mg多聚赖氨酸粉末溶解于98ml0.94%硼酸溶液配制100ml. 0.22μM过滤分装，-20°C储存，避免反复冻融。 包被：按10cm皿用4ml包被液进行包被，4°C过夜或37°C 2 小时后，吸干，回收包被液，包被过的皿置4°C保存可达一个月，临用前用PBS或灭菌的去离子水洗3遍再使用，整个包被过程均为无菌操作。 多聚赖氨酸溶液是广泛应用的组织切片与玻片黏合剂，该多聚阳离子分子与组织切片上的阴离子相互作用会产生较强的黏合力。也可用于细胞培养，增加细胞贴壁能力。多聚赖氨酸包被培养板使用前是用灭菌的去离子水稀释，最好不要用双蒸水或别的，因为多聚赖氨酸包被的原理是通过改变器皿表面的电荷而促进细胞的黏附。 2. 0.1% I型胶原酶 （1mg/ml） 100mg I型胶原酶溶于100ml D-hank’s液中，过滤后4°C保存。 3. D-hank’s液 （可以直接购买使用） KCl 0.40g， KH2PO4 0.06g，NaCl 8.00g, NaHCO30.35g, NaH2PO4·7H2O 0.09g，酚红0.01g。以上均为分析纯，加三蒸水定容至1L后高压灭菌，4℃分装备用; 4. 血清的灭活: 常用的血清要先在56℃水浴中灭活30min方可使用。灭活后-20℃保存备用; 5. 细胞生长液的配制(100mL): 即含20%胎牛血清的DMEM/F12培养液。取20ml灭活的血清，再加青、链霉素各100IU，然后用DMEM/F12培养基补充到100 mL，4℃保存备用。 6. 0.1%胶原酶II(100 mL)的制备:称取胶原酶II 100mg用100mL DMEM/F12液充分溶解，0.22μM过滤后分装备用，-20℃保存; 7. 75%乙醇 8. Mini-Q(超纯水)--灭菌无离子水 实验器械 1、培养皿 2、培养瓶 3、直剪和眼科剪 4、眼科镊和止血钳 5、烧杯 6、15ml离心管 三、正常小鼠原代骨骼肌细胞培养实验流程 取肌肉于平皿，Hank’s洗3次 ↓ 剔除脂肪、结缔组织 ↓ 肌肉标本剪约0.1cm3小块 ↓ 移至离心管，Hank’s洗3次 ↓ 静置1min，弃去上层液及漂浮组织 ↓ 0.25%胰酶，37度水浴消化20min，每5min摇动或吹打1次 ↓ 生长培养基终止消化，反复吹打，依次100，200，400目过筛 ↓ 离心，1000rmp,10min，弃去上清 ↓ 重悬，计数细胞，接种密度以5 × 105个/ml ↓ 悬液加入未经PPL包被培养瓶中，差速贴壁去除成纤维细胞，37度，1h ↓ 转移包被瓶中，生长培养基培养，培养37℃，5%CO2 ↓ 4d换液，以后每天换 四、实验操作 1、新生小鼠拉颈椎处死，乙醇消毒腿部，在超净工作台内，取肌肉于平皿，Hank’s洗3次，剔除脂肪、结缔组织，将肌肉标本剪约0.1cm3小块； 2、将剪碎的肌肉移至离心管，Hank’s洗3次，静置1min，弃去上层液及漂浮组织； 3、向上述离心管中加入0.25%胰酶，37度水浴消化20min，每5min摇动或吹打1次离心管，然后加入生长培养基终止消化； 4、反复吹打后，依次100，200，400目过筛，滤液收集后，1000r/min离心10min； 5、弃去清夜，用生长培养基重悬细胞，悬液加入未经PPL包被的培养瓶中，差速贴壁去除成纤维细胞，37度培养1h后，转移包被瓶中，生长培养基培养，4d换液，以后每天换液1次。 ? 五、细胞鉴定 1、显微鉴定：刚分离出的原代细胞比较小，呈球形，折光性强。12h后，细胞开始贴壁，72h后贴壁完全，细胞逐渐延展成梭形，随着培养时间的延长，细胞增殖、迁移并逐渐规律性地沿一个方向排列。当细胞融合80%以上后，开始形成肌管。 ? 2、免疫细胞化学染色1：肌卫星细胞胞浆中含有结蛋白（desmin），可采用鼠抗人及小鼠desmin一抗对卫星细胞进行免疫染色鉴定。 ? 3、免疫细胞化学染色2：采用骨骼肌特异性的肌球蛋白（myosin）单克隆抗体检测。取含骨骼肌细胞盖玻片常规处理后进行myosin的细胞免疫化学染色，PBS代替一抗做阴性对照。结果判定：以细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性染色。 ? 六、注意事项 1、胰酶消化过程中，也可采用15min两步消化的方法进行。根据所取组织个体年龄决定，一般成年大小鼠采用两步消化效果好，幼鼠一步消化和两步消化差别不大。 2、传代培养代数不要太多，骨骼肌细胞传代能力有限，容易死亡。 3、骨骼肌细胞培