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高三尖杉碱酯 摘要：高三尖杉醋碱(Homoharringtonine, HHT)是从我国特有三尖杉属植物海南粗框中分离得到的有效抗癌药物，我国从七十年代起率先将其用于急性髓系白血病(AML)和慢性髓系白血病(CML)的临床治疗，疗效显著。研究表明HHT对AML和CML细胞作用时，可以激活caspase家族中caspase3, caspase8, caspase9等，诱导白血病细胞凋亡。 关键词：生物碱，白血病，提取 高三尖杉碱酯的物理性质 高三尖杉碱酯（Homobarringtonie 缩写HHT）又名：高粗榧碱，后哈莫林通碱，高俣林通碱 分子式：为类白色或微黄色结晶性粉末或无定形疏松固体；有引湿性；遇光色变深。在甲醇、乙醇或氯仿中易溶，在水或乙醚中微溶。熔点本品的熔点为143～147℃。 二、高三尖杉碱酯 高三尖杉酯碱可以用以下方法获得： 将三尖杉属植物的茎、叶、根、果皮经细胞悬浮培养或组织培养和次级培养； 也可以从含有HHT的植物材料或培养细胞或植物组织经溶媒提取、分离、精制得到；还可以从提取过的三尖杉属植物的残渣中经半合成方法获得。此外，HHT还可以与其他植物成分如：贯众素、麦冬素、苦参碱和靛玉红合并使用,能使癌细胞转化为正常细胞,诱导癌细胞凋亡,抑制癌细胞生长。 （一）中国粗榧的枝叶中高三尖杉酯碱的分离和提取 1．　试验材料: 中国粗榧的干燥枝叶、粉碎。试剂:乙醇、氯仿、乙醚均为化学纯, 柠檬酸、磷酸氢二钠。标准品购于中国药品生物制品检定所。 2．实验方法 （1）　回流提取: 将粉碎枝叶用90%乙醇浸没, 加热回流提取3次, 提取液合并置浓缩器中, 减压浓缩回收乙醇至流浸膏。 （2） 梯度萃取: 将流浸膏用5%醋酸溶解，浓氨水调节pH值。用氯仿在pH= 3，6，9 时梯度萃取。pH= 3，9的萃取物为杂质，另浓缩; pH=6的氯仿萃取液减压浓缩至膏, 为所要总生物碱。 （3） 逆流分布法: 用柠檬酸和磷酸氢二钠配制pH=4左右的缓冲液为固定相，流动相为氯仿二相互相饱和。用流动相把pH= 6 获得的样品溶解, 放在分离器中进行逆流分布。用薄层跟踪检查各分离器的上、下层溶液,至获得高三尖杉酯碱的单一成分的粗制品时分别收集、待精制。 （4）精制——吸附柱层析法: 用作吸附剂，将高三尖杉酯碱抽松后的粗品用适量二氯甲烷溶解上柱,用乙醚洗脱,等量收集流出液,流出液用薄层检查,所得高三尖杉酯碱即为纯品。 ( 5)　薄层层析检测: 硅胶G加1%NaOH, 湿法制板, 晾干过夜。展开剂: 乙醚-丙酮( 2∶1) 。显色剂:改良碘化铋钾试液, 呈红色棕色。经质谱和红外光谱鉴定, 所分离样品与标准品一致。 （二）　中国粗榧的果实高三尖杉酯碱的分离和提取 1．　生药处理: 将果实脱去果肉、果壳, 取果仁榨去油, 残渣用石油醚脱去残存油脂, 挥发去溶剂, 得果仁脱脂粉末。 2．　提取总生物碱: 用95% 乙醇冷浸果仁粉末,渗滤至渗漉液无生物碱沉淀反应, 渗漉液减压浓缩回收乙醇至流浸膏。 3．梯度萃取: 同（一）?2 4　逆流分布法分离三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱: 同（一）?3 5　精制—— 吸附柱层析法:同（一）?4 6　薄层层析检测: 同（一）?5 三、高三尖杉碱酯药用原理新近展 1. HHT抑制急性髓系白血病细胞株细胞的生长 通过实验首先采用不同浓度HHT (0-80ng/ml于K562和HL60细胞，0-40ng/ml于U937细胞)分别作用3种AML细胞株细胞K562, HL60和U937细胞24h,48h和72h，采用MTT法检测HHT对细胞生长的影响。结果显示:HHT能显著抑制这3种细胞株的生长。随着HHT浓度的升高，各细胞株细胞存活率逐步降低(见表1, 2, 3和图1, 2, 3)，对这种药物剂量与生长抑制作用做直线相关分析，并对相关系数r值做假设检验。3种细胞在各自时间点的生长抑制率都与HHT剂量呈正相关，说明HHT对AML细胞株细胞的生长抑制作用呈剂量依赖性。此外，HHT对3种细胞株的生长抑制作用也呈时间依赖性.同一浓度下，药物作用时间越长，细胞存活率也越低。同一细胞株中，药物作用时间越长，IC50也越低。HHT对K562, HL60和U937细胞在24h的IC50依次是: 44.53ng/ml, 29.32ng/ml, 7.69ng/ml;处理48h后，各细胞株的IC50分别是: 23.92ng/ml, 19.91ng/ml, 5.50ng/ml;而处理72h后，各细胞株的IC50分别是: 17.75ng/ml, 15.71ng/ml、5.37ng/mlo 表1 HHT对k562细胞生长的影响(MTT法)(N=3) Conc Cell Viability(of%control