2013两水相系统中蛋白质分配系数及测定.pptVIP

上课前： 每组清洗一个50ml容量瓶 用蒸馏水润洗后备用 不用烘干 两水相系统中蛋白质 分配系数的测定 指导教师：龚小雁 张秀萍 了解蛋白质在两水相系统中分配系数的测定方法。 一、实验目的和要求 本实验中： 二、实验原理 两水相系统： PEG/(NH4)2SO4 分配对象：糖化酶 蛋白含量测定方法：考马斯亮蓝比色法 两水相分配： 在两水相系统中，生物物质与成相组分之间通过疏水键、氢键和离子键等相互作用而不同程度地分配在两相中。 分配系数K ： 当萃取达到平衡时，蛋白质在上下两相中的浓度之比，对于固定的相系统，K为常数。 K = C上/ C下 相比R ： 上下相体积比。 R = V上/ V下 二、实验原理 二、实验原理 糖化酶： 生物大分子蛋白，α-１,４-葡萄糖水解酶。 黑曲霉经发酵制得 。 广泛用于酒、醋、味精等发酵工业中起糖化作用，将淀粉转化为葡萄糖 。 考马斯亮蓝比色法： 常用的蛋白含量检测方法。 考马斯亮兰G-250是一种染料，酸性溶液中呈棕红色，与蛋白质结合后转为蓝色，595nm波长下有最大吸收值。低浓度范围内（0.01～1.0mg/ml），与蛋白质浓度的关系服从比尔定律。 二、实验原理 试剂： PEG400、蒸馏水、(NH4)2SO4、糖化酶、考马斯亮蓝、牛血清蛋白等。 器材： 移液管、刻度离心管+盖子、台秤、离心机、试管、50ml容量瓶、恒温水浴锅、分光光度计+比色皿等。 三、实验器材与试剂 （一）试剂配制（已配好） 考马斯亮蓝G-250溶液：精确称取50mg考马斯亮蓝，溶于10ml 95%乙醇中，并加入50ml 85% 浓磷酸，用H2O稀释定容至500ml。 牛血清蛋白溶液 （BSA）：精确称取0.012g左右的牛血清蛋白，加入0.105gNaCl,溶于少量蒸馏水中，然后，稀释定容至100ml，配成 120?g/ml的牛血清蛋白原液。 四、操作方法 （二）蛋白质在两相中的分配 10ml刻度 离心试管 (NH4)2SO4 固体1.30克 PEG400 2.00克 糖化酶2.00ml 水 台秤 总重8.00g 振摇混和 (固体充分溶解) 离心 3000转/分 5min 求相比： R =V上/V下 求分配系数 ： K = C上/ C下 四、操作方法 平衡 （三）考马斯亮蓝比色法测定蛋白质含量 制作标准曲线：在试管中，按下表精确加样，反应检测。 两相中取样及蛋白测定： 上相液：吸取0.5ml，蒸馏水定容至50ml，取1ml稀释液于试管中，按下表反应检测。 下相液：吸取0.1ml于试管中，加入0.9ml水，按下表反应检测。 标准曲线 样品检测 BSA/ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 上相稀释液1.0ml 下相稀释液1.0ml H2O/ml 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 加考马斯亮兰5.00ml，混匀，25℃±1℃保温10分钟，冷却 OD/595nm 蛋白量?g 空白对照 绘制标准曲线： 标准曲线方程（线性回归）： 蛋白量：y=ax+b 上相：C上=(ax1+b)*100 ug/ml 下相：C下=(ax2+b)*10 ug/ml 分配系数的计算： OD 蛋白含量/μg 分配系数 K = C上 / C下 操作注意点 蛋白质分配： 称重时，按顺序加入物料，中间不要再去皮，最终控制累积总重8.00g。 橡皮塞不干净，用保鲜膜包裹下。 离心前试管必须要两两称重平衡。 取样： 不要取相界面附近的样品。 取下相样品液时，先用滴管将上相完全吸掉，并吸掉部分下相后，再取样。 避免将上相混入下相。 检测： 试管中加完物料后，要混和均匀。 保温结束后，立即放入冷水中，待测。 分光光度计空白参比管T模式调100%，A 模式调0 。 （一）预习 配制两水相萃取系统时，PEG400液体的加量能否改为量取相应的体积？说明理由。 试述使用台式离心机的操作顺序。 用比色法分析上下相蛋白质浓度时，如何精确吸出在同一离心试管中的上下两相？写出操作步骤。 （二）实验结果和讨论 将比色分析的操作过程及结果列成表格，作出标准曲线，线性回归。 计算上下相蛋白质浓度、分配系数K、相比R，计算两相中PEG和(NH4)2SO4的含量。 在配制两水相系统时，为什么必须充分混合？混合不充分会带来什么影响？ 五、思考题 M：系统组成 T：平衡时上相组成 B：平衡时下相组成 TMB：系线