分子生物学第五章 分子生物学及常规技术(六).ppt

第五章 分子生物学的常规技术（六）——DNA文库的构建 和目的基因的筛选 基因文库： 也称DNA文库，是指某一生物体全部或部分基因的集合。 某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落(或噬菌体)，所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库(gene library)。 基因文库: 外源DNA片段 载体 宿主 等3个部分组成。 构建基因文库的基本程序： ①提取研究对象基因组DNA，制备合适大小的DNA片段，或提取组织或器官的mRNA并反转录成cDNA； ②DNA片段或cDNA与经特殊处理的载体连接形成重组DNA； ③重组DNA转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌； ④阳性重组菌落或噬菌斑的选择。 基因文库(外源DNA片段的来源)分为： 基因组DNA文库(genomic DNA library) cDNA文库(complementary DNA library) 基因组DNA文库: 是指将某生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。 将庞大的基因组分解成许多片段，每段包含一个或几个基因。 cDNA文库: cDNA文库代表生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内转录水平上的基因群体。 由于基因表达具有组织和发育时期特异性，因此cDNA文库所代表的基因组具有同样的时空特性，它仅包含所选材料在特定时期里表达的基因，并不包括该生物的全部基因，且这些基因在表达丰度上存在很大差异。 基因组文库与cDNA文库最大的区别： cDNA文库有时空特异性。 常用的文库筛选方法有： 核酸探针杂交法 抗体免疫法 差异杂交法。 必须根据所研究基因的各种信息，如表达丰度、蛋白质特性和DNA序列等，以及基因文库的特点和类型选择适当的筛选方法。 二、基因组DNA文库的类型 1．质粒文库 质粒是最早用于构建基因组文库的载体，现已发展了数十种适用于基因克隆、表达和测序等不同目的的质粒载体。 质粒载体所容纳的外源DNA片段一般在10kb以内。 这类基因组DNA文库一般应用于“鸟枪法”全基因组测序研究利用于构建亚克隆文库或亚基因组文库。 2．噬菌体文库 噬菌体文库是以细菌噬菌体基因组衍生的一系列载体系统构建的； 常用的有λ噬菌体载体，M13单链噬菌体载体，P1噬菌体载体及由噬菌体衍生的质粒载体(phagemid或phasmid)。 M13载体所容纳的外源片段较小，一般用于构建cDNA文库或BAC和PAC亚克隆文库。 噬菌体文库中应用最广的是λ噬菌体。由于其有利于利用分子杂交的方法进行筛选，用λ噬菌体构建的基因组DNA文库在小基因组物种的基因克隆中起着重要的作用． 3. 黏粒文库 黏粒又称柯斯质粒，是由λ噬菌体的cos序列、质粒的复制序列和抗生素抗性基因构建而成的一类特殊的质粒载体。 黏粒载体主要用于构建小基因组物种的基因组DNA文库。有时也用于构建大基因组物种的基因组DNA文库，利用它们的某一区段，如基因组DNA某一特定大小酶切片段的组合、一条染色体或更小的区段。 4.人工染色体文库 包括酵母人工染色体文库、细菌人工染色体文库和P1人工染色体文库。 又称大片段基因组DNA文库，容纳外源DNA片段为100kb-1Mb. 用于大基因组物种基因克隆、物理图谱构建和基因组测序。 5.亚基因组文库 ——文库对象是基因组的某一区段。 1）通过Southern杂交可以判断出携带目的基因的DNA片段大小，此时可以利用内切酶对基因组DNA进行消化并回收这一大小的DNA片段来构建文库进行基因的筛选； 2）利用原位杂交等技术将基因定位于某一条染色体，然后通过显微切割的方法分离单条染色体来构建亚基因组文库； 3）先将基因定位于一个YAC或BAC克隆，再构建该克隆的亚基因组文库． 一般而言，亚基因组文库主要应用在基因组较小的物种基因克隆或大基因组物种的后期研究。 6 基因组文库的发展 90年代，一些高等真核生物基因组研究计划启动，建以大片段克隆重叠群为基础的染色体物理图谱． 由于构建果蝇、拟南芥以及人等的染色体物理图谱的需要，先后发展了多种可容纳大片段的克隆载体，如YAC、P1、