分子克隆中所用酶.ppt

核糖核酸酶(Rnase)专门水解断裂RNA分子, 脱氧核糖核酸酶(DNase)特异水解断裂DNA分子 。 按水解断裂核酸分子的不同方式核酸酶分为两种类型： 核酸外切酶(exonuclease) :从核酸分子的末端开始，一个核苷酸一个核苷酸地消化降解多核苷酸链。 核酸内切酶(endonuclease):从核酸分子 内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段。 一把特殊的剪刀_______限制性内切酶 限制性内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并在识别位点或其附近切割DNA双链的核酸内切酶。 主要是从原核生物中分离纯化出来的。 据统计数字，仅Ⅱ型核酸内切限制酶一项迄今就已从各种不同的微生物当中，分离出了2300种以上、可识别230种不同的DNA序列。目前已经发现3500种以上，而且商业化的有250种之多． I型：能识别专一的核苷酸顺序，在距识别点数千碱基处随机切割DNA分子中的双链。 III型：有专一的识别顺序。它在识别顺序下游约25bp处几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对则是任意的。 　II型：识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内或附近的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。所以总能得到同样核苷酸顺序的DNA片段，并能构建来自不同基因组的DNA片段，形成杂合DNA分子。 绝大多数的Ⅱ型核酸内切限制酶，都能够识别由4一6个核苷酸对组成的特定的核苷酸序列，我们称这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。而限制酶就是从其识别序列内切割DNA分子的，因此识别序列又称内切酶的靶子序列。 识别序列通常具有二重旋转对称轴，序列呈回文结构（palindromic structure）。即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”核苷酸顺序都完全相同。 粘性末端与平头末端 有些来源不同的限制酶却识别和切割相同的序列，这类限制酶称为同裂酶。 同裂酶产生同样切割，形成同样的末端，酶切后所得到的DNA片段经连接后所形成重组序列，仍可能被原来的限制酶所切割。 同裂酶的反应条件可能存在差异。 “完全同裂酶”能识别和切割完全相同的序列，如Hind III与Hsu I，（A/AGCTT） “不完全同裂酶”虽能识别相同序列，但切割方式不同，如Xma I和Sma I。（CCCG/GGG和CCC/GGG） 　 （1）识别顺序不同，切割方式也不同; (如EcoRⅠ和Pst I，前者产生的是5’粘端，后者产生的是3粘端。) 　（2）识别顺序不同，切割产生的粘末端相同；(同尾酶) 　（3）识别顺序相同，切割方式不同； (如Sma I与Ⅹma I) （4）相同的识别顺序，切割方式亦相同； 　（1）DNA样品的纯度： 　（2）DNA的甲基化程度： 　（3）酶切消化反应的温度： 　（4）DNA的分子结构： 　（5）核酸内切限制酶的缓冲液： (6) 酶的纯度 　　DNA连接酶(Iigase)：能借助ATP或NAD水解提供的能量催化2条双链DNA片段紧靠在一起的3‘羟基末端与5’磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接的酶。 　 E. coli DNA连接酶：简称DNA连接酶，是由大肠杆菌染色体编码的。只能催化双链DNA片段黏性末端之间的连接，不能催化双链DNA片段平末端之间的连接。用NAD+作能源辅助因子 。 T4DNA连接酶：是由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的。既可用于双链DNA片段黏性末端之间的连接，也能催化双链DNA片段平末端之间的连接，但平末端之间连接的效率比较低。用ATP作作能源辅助因子。 连接反应的最佳温度为4-15℃ 其中，DNaseⅠ的作用是在DNA分子上造成断裂或缺口，使之带有3′-OH末端；随后DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′的核酸外切酶的活性从缺口的5′-P一侧移去一至数个核苷酸；同时，DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′的聚合酶的活性将α-32P-dNTPs和未标记的dNTPs随机掺入，取代已经被移走的核苷酸；DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′的聚合酶的活性和5′→3′的核酸外切酶的活性不断地重复以上的作用，使DNaseⅠ造成的缺口沿着5′→3′的方向移动。5′-P侧的核苷酸不断被移去；3′-OH侧的核苷酸又按序填上，形成带上了α-32P-dNTPs标记的新合成的DNA链，取代了原有的未标记的DNA链。这种使DNA带上放射性同