改分子生物学实验实验操作.pptVIP

重组人白介素-18(rhIL-18)基因工程菌的构建;基因、载体、受体菌株;实验技术要求;实验流程: 第一天 8AM-5PM;实验流程: 第二天 8AM-5PM;实验流程: 第三天 1PM-5PM;实验流程: 第四天 8AM-5PM;双酶切反应（20μL体系）;Hybrid site;培养基配制;灭菌;琼脂糖电泳;琼脂糖凝胶的配制;琼脂糖凝胶回收;1.柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500μL平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 2.将单一的质粒条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。 3.向胶块中加入3倍体积胶液PN（如凝胶重为0.1g，其体积可视为100μL，依此类推）。50℃水浴放置10min，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟，直至胶块溶解（若胶块的体积过大，可事先将胶块切成???块）。（将目的基因体积补至50μL，由此步平行操作。） 注意：胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高温度时结合DNA的能力较弱。 ;;;平板铺制;连接反应;酶切产物比例换算;感受态菌的制备;pUC18-hIL-18重组质粒的转化;（2）将该EP管放入预加温至42℃的水浴中，放置90s，快速转移到冰浴中，使细胞冷却1~2 min。 （3）向EP管加入800 μL LB培养基，转移至37℃摇床上，150r/min，温育45 min以复苏菌株。;;感受态细胞转化效率的计算;UNIQ-10柱式质粒小量抽提;;;PCR鉴定阳性克隆原理;PCR鉴定;3．PCR 反应循环条件设置 94℃变性反应30s； 45℃退火反应30s； 72℃延伸反应30s。 进行20个循环后，最后一个循环72℃延长至10min。 4、检测 加 2μL 6 × Loading Buffer和10μL 反应产物，混匀，取15μL 反应产物点样电泳。 5、成像分析 在 1% 的琼脂糖凝胶上点样电泳0.5~1h，电泳结束后EB 染色15～20min，凝胶成像分析结果。