由于Tilling技术应用时需要进行化学诱变.DOC

Li-Cor 4300 DNA遗传分析系统及主要应用方向 Li-Cor 4300 DNA遗传分析系统采用双色红外荧光检测技术RNA抑制、RNAi和插入突变是植物中常用的用于反向遗传学的研究方法，但这三种技术均需复杂繁琐的植物转基因表达载体构建过程以及组织培养、基因转化和周期极长的转基因植物筛选过程，作为常规方法仅限于应用于极少数物种。 为了更好的进行植物功能基因组学研究，美国华盛顿Fred Hutchinson 癌症研究中心的研究者们建立了一种全新的反向遗传学方法——定向诱导基因组局部突变（Targeting Induced Local Lesions In GenomesTILLING）TILLING 技术路线 TILLING技术先用化学诱变剂诱发产生一系列的点突变，提取突变体M2代的DNA，把多个待测样品的DNA混合在一起进行PCR，PCR产物通过先变性再复性过程得到异源双链。如果样品发生点突变，则形成的异源双链中必定含有错配碱基，利用特异性的内切核酸酶识别携带了错配碱基的异源双链并在错配处切开双链，最后进行电泳检测试验结果。如果发现阳性结果，则再在混合的样品中逐一检测，最后确定阳性样本。 Colbert 等所描述的TILLING技术主要操作流程见表1。这个过程中起重要作用的CEL1酶是从芹菜（celery）中分离出来的植物所特有的核酸内切酶，它能够识别单碱基错配并在错配碱基的3’端进行切割，酶切产物经变性PAGE胶分离，能将超过1kb的PCR产物内的点突变定位在几个碱基对内。 表1：植物中TILLING的技术路线 1 ?EMS(Ethyl Methane Sulfonic acid)处理种子诱导产生一系列点突变 2 将种子培养，获得第一代突变个体 3 M1植株自花授粉，产生第二代 4 ?M2植株抽提DNA存放于96孔板 5 将多个96孔板的样本合并到1个96孔板内（最多可合并8个），特异性引物进行PCR扩增，两引物分别用700nm和800nm荧光染料标记。 6 7 用特异识别并切割错配碱基的核酸内切酶（CEL1）剪切异源双链核酸分子 8 酶切产物变性产生两条DNA单链分子，其碱基数目之和与酶切之前片断碱基数相同 9 酶切产物在Li-Cor 4300DNA分析系统上经变性的聚丙烯酰胺（DPAGE）凝胶电后泳，分别得到700nm和800nm两张图。发生突变的泳道，在700nm的图上可以在野生型条带下方看到一个条带，同时在800nm的图上相同的泳道也会有一个条带，这两个条带就是CEL I核酸酶的剪切产物，两个条带片断大小之和等于扩增片段的大小，从而很容易对扩增产物进行突变检测 10 当混合样本检测到突变后，要对混合样本中的每个DNA样本再次进行筛选，检测出发生突变的DNA样本。 2．TILLING技术的特点 2.1 一种全新的反向遗传学研究方法 传统的化学诱变方法，能诱发产生高密度的点突变，不仅便于农作物诱变育种的实际所需，也有助于基因的精细定位和了解蛋白质的功能，在基因功能的分析方面具有独特的技术优势。传统化学诱变方法在表型选择方面依旧被广泛利用，但点突变鉴定困难限制了其在功能基因组学研究中的应用。 与其它基因敲除的突变方法相比较，TILLING技术的基本点是诱发突变和突变的高效筛选，即有效结合高频率点突变和PCR筛选技术，可发现错义突变、基因截短型损伤等突变类型，表现了三方面的技术优势：（1）可获得大量的等位基因系列，对一些表型分析时可能涉及的亚致死必需基因、长度很小基因、复等位基因等具有独特的技术优势；（2）可诱导产生高频率的点突变，筛选目的基因需要较小的突变群体；（3）不依赖于农杆菌介导转化或内源标签系统，无需耗时的转基因和复杂的组织培养过程。 2.2 高通量、低成本，可自动化操作 由于集成了高通量的电泳检测设备、优秀的图像处理系统和分析软件及一种能够给96孔微量滴定板自动加样设备等多种技术，TILLING可自动化操作。目前，在拟南芥TILLING研究计划中（ATP，Arabidopsis TILLING Project）已实现完全自动化。 对突变体的规模化筛选，TILLING无需借助先进的仪器设备，是一种高通量且相对廉价的实用技术。筛选每块96孔微量滴定板相当于筛选了768 (8 ×96) 个M2单株，每个目标筛选区段大约为1kb，每块胶大约可以检测750kb 的基因组序列。一个技术员一天就能完成4轮筛选，可检测3000个突变株，相当于检测了300万个碱基对。对于突变频率高的群体，一天可筛选出20个突变，至少可以鉴定出一个基因。 2.3 能有效排除假阳性 TILLING采用了双色红外荧光检测技术（通过Li-Cor 4300 DNA 遗传分析系统）来检测CEL I 酶切产物，能够有效