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一班401宿舍：气相色谱在生物领域的应用 一班402宿舍：高效液相色谱在生物领域的应用 一班403宿舍：电泳（毛细管电泳）在生物领域的应用 §3－1 高效液相色谱法的特点 一、高效液相色谱法概述 高效液相色谱法（HPLC）在经典液相色谱基础上，采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点，因此得到迅猛的发展。目前已成为应用极为广泛的化学分离分析重要手段。 1．高效液相色谱法与经典液相色谱法的比较 高速：在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达 103cm·min-1. 例如分离氨基酸，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径0.9cm，流动相速度为30cm3·h-1，需用20多小时才能分离出20种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需lh之内即可完成； 2．高效液相色谱法与气相色谱法的比较 （l）气相色谱法分析对象只限于气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定性差、离子型化合物及摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析； 三、离子对色谱（ion pair chromatography） 原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水 性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配； 阴离子分离常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十 六烷基三甲铵作为对离子； 阳离子分离常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子； 四、离子交换色谱（ion-exchange chromatography） 固 定 相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 流 动 相：盐类的缓冲溶液。通过改变流动相的pH、缓冲剂（平衡离子）的类型、离子强度以及加入有机溶剂、配位剂等都会改变交换剂的选择性，影响样品的分离。 3） 化学键合固定相 化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； c. 硅碳键型： ≡Si—C d. 硅氮键型： ≡Si—N 化学键合固定相的特点 1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快； 2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击； 3）耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定； 4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性； 5）有利于梯度洗脱； 一、流动相类别 按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动 相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。 二、选择流动相时应注意的几个问题 1 纯度要高 溶剂的纯度极大地影响色谱系统的正常操作和色谱分离效果。溶剂中若存在杂质会污染柱子，存在固体颗粒会损害高压泵或输液通道，使压力升高，基线漂移。 2 粘度要低 高效液相色谱中为获得一定流速必须使用高压，若溶剂粘度较高，操作压力也更大。高的压力会使色谱柱性能降低，而且泵也容易损坏。 3 化学稳定性好 流动相不能与固定相或组分发生任何化学反应。 4 溶剂沸点要高于55℃ 低沸点溶剂挥发度大，容易使流动相浓度或组成发生变化，也容易产生气泡。 三、 流动相选择 在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 采用正相液-液分配色谱分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，也可先低极性溶剂，再逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。 反相色谱中通常以水为流动相主体，加入不同的有机溶剂作调节剂。 常用的有机溶剂：甲醇、乙腈、二氧六环和四氢呋喃等 §3－6 高效液相色谱仪 高效液相色谱仪的一般可分为4个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统,另有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。 一．高压输液系统 由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是核心部件。对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，