分离科学八高效毛细管电泳.ppt

聚丙烯酰胺凝胶毛细管的制备 （1）毛细管内壁处理： 用碱溶液、酸溶液、甲醇清洗后，冲入双功能团试剂如γ-甲基丙烯酰氧基三甲氧基硅烷（MAPS），室温反应至少3小时，然后用甲醇和水冲洗。这样处理后得到键和有双键的表面，在丙烯酰胺聚合时双键参与聚合从而将凝胶固定增加稳定性。 第八章 高效毛细管电泳 （2）聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺（Acr）、交联剂甲撑双丙烯酰胺（Bis），在过硫酸胺（APS）-四甲基乙二胺（TEMED）化学聚合或者核黄素-TEMED光聚合系统催化下聚合完成。溶液需脱气 （3）聚合溶液引入毛细管，进一步与管壁双键进行反应。 第八章 高效毛细管电泳 气泡的消除： 加压条件下或者减压条件下聚合 采用逆向电泳法聚合：在充满聚合溶液的毛细管中，通过逆向电泳将催化剂和引发剂从毛细管一端引入进行交联，聚合时凝胶收缩产生的溶液空缺由从容器中引入的单体溶液得到实时补充。 加入消泡剂或变性剂，如乙二醇、甲酰胺等。 第八章 高效毛细管电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳特点： 凝胶粘度大，抗对流，能减少溶质的扩散，峰型尖锐，柱效极高，达到107塔板/米。 分离度达到可以分辨DNA片段单碱基的能力。 迁移时间重现性好。 稳定性和寿命与凝胶本身有关，好的凝胶可以重复使用150~200次。 当被分离的分子的大小与凝胶的孔径相当时，其淌度与尺寸大小有关，淌度随蛋白质分子量的增加而递减。 毛细管凝胶电泳比平板凝较电泳具有更好的自动化和定量分析性能。 第八章 高效毛细管电泳 影响CGE分离的因素： 管壁预处理后（硅烷化），得到更加对称的峰形； 凝胶浓度低，孔径大，溶质迁移速率增大，分离速度快； 缓冲溶液pH：pH影响溶质的淌度。制备凝胶的溶液pH与操作缓冲溶液pH不相同时，需要平衡一段足够长的时间。平衡时间对分离度、峰序和流出时间有影响。这些现象的原因还不十分清楚，但提醒人们，除非特殊情况，否则聚合溶液pH与操作缓冲溶液pH尽可能相同。 第八章 高效毛细管电泳 温度升高，电阻降低，在恒压模式下电流增大。对于DNA限制片段，柱效降低。 电场强度越高，迁移速率越快。对于较小分子，迁移速度与E成正比；但对于较大的分子，则偏离线性，迁移速度比预期的更快。 第八章 高效毛细管电泳 假设相邻峰峰宽相同，分离度可以近似表示为： 显著依赖两组分的相对淌度差（ ）和峰的总方差。电场强度对相对淌度差的影响和分子大小有关。对于较小的分子，相对淌度差受E影响小，随着E增大，分离度增大。当E进一步增大时，由于焦耳热导致的温度效应而降低；对于大分子，相对淌度差随E增大显著减小，从而导致分离度降低，这就是分子量很大的分子需要在低电压下分离的原因。 第八章 高效毛细管电泳 凝胶柱的操作特点 毛细管柱接到仪器上后，应立即使其通入缓冲液，以避免脱水，防止胶的干裂。 先用标准化合物运行一遍以确保仪器和柱子性能正常。 凝胶电泳通常采用电动进样，如果采用压力进样，胶可能被从毛细管中挤出。 柱子可以在较高温度下运行。（扩散系数小） 第八章 高效毛细管电泳 使用的电场强度需低于400V／cm，否则易使柱内凝胶龟裂。 样品溶液的离子强度要低，以尽可能增大进样量。离子强度对定量和分离效率特别重要，它的变化还会导致响应因子的变化。 采用系列标准物以确保相对迁移时间的重复性。 缓冲液宜经常更换。 第八章 高效毛细管电泳 其他筛分介质 琼脂糖（AG），空隙大，机械强度高，生物惰性，有很好的抗对流性。分离DNA时，分离度稍差，但迁移速度快 Hydrolink胶，与PAG相比，有较高的机械强度和样品负载，但柱子的重现性、稳定性和分离性能有待提高。 高聚物溶液筛分介质：葡聚糖和聚乙二醇等。特点是装柱容易，不会出现气泡，电泳后能够方便地从毛细管中排出。此外是紫外透明的。选择性和柱效与线性PAG相当。(无胶筛分) 第八章 高效毛细管电泳 无胶筛分电泳中，较为常用的是甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素。这些聚合物溶于水后，在浓度较高时，可形成类似于凝胶的多孔结构，从而进行筛分分离。 纤维素衍生物种类较多，分子量大小及粘度各异，对不同大小的DNA片段分析。 无胶筛分电泳操作简单，化学性质稳定，正受到愈来愈广泛的重视。 第八章 高效毛细管电泳 溶质在凝胶柱中的迁移模型 Ogston模型 假设基质由互相连接的无规则网络所组成，其空隙平均孔径为x。迁移的溶质就象一个半径Rg的不变形粒子。因此，较小的分子有更多的孔隙可以利用而迁移速度快。根据这种假设，溶质在凝胶中的电泳淌度为： ?0是溶质在自由溶液中的淌度，r是股绳厚度。 第八章 高效毛细管电泳 Ogston模型未考虑电场强度对粒子形状的影响