3高效壹昂相色谱法-2013.ppt

一、高效液相色谱中的速率方程 迁移的流动相 滞留的流动相 涡流扩散项 纵向扩散 流动相传质 滞留区传质 固定相内传质 二、高效液相色谱仪 1.仪器流程 2. 检测器 固定波长 可变波长 二极管阵列(DAD) A.固定波长的紫外检测器 典型的流通池结构 B. 可变波长的紫外检测器 C. 二极管阵列检测器 3-D plot of DAD D. 紫外检测器的特点 选择性检测器 高灵敏度 线性宽 稳定 可做梯度 HPLC的常规检测器 (2) 示差折光检测器 B. 示差折光检测器的特点 通用 灵敏度低 温度敏感 改变流动相要重新平衡体系 不能做梯度 (3) 荧光检测器 B. 特性 高选择性 高灵敏度 干扰少 可做梯度 激发波长和发射波长皆可变化 (4) 蒸发光散射检测器(ELSD) B. ELSD的特性 通用型 灵敏度较高 方便 可梯度 响应与质量有关 (5) 电化学检测器 Conductivity detection: 电导检测器 DC Amperometric detection: 直流安培检测器 Integrated and pulsed amperometric：积分或脉冲安培 B. 特点 选择性检测器 灵敏度高 电导检测器是离子色谱的常规检测器 DC amperometry: 神经化学类物质的检测 Pulsed amperometry:碳水化合物的检测 3. 仪器附件 Degas 脱气机 Gradient 梯度装置 Column Thermostat 柱温箱 Auto sampler 自动进样器 Fraction collector 馏分收集器 梯度洗提 梯度洗脱即程序控制流动相的组成，使在整个分离过程中，溶剂强度按照特定的变化规律增加。 优点：分离复杂混合物，使所有组分都处在最佳的k值范围内。 实现方式 对于复杂样品，线性梯度是最好的。 正相色谱中，常用二氯甲烷加入到正己烷中来实现。 反相色谱中，乙腈，甲醇加入到水中是最常用的。 三、HPLC主要类型及其选择 化学键合相色谱法 液固色谱法 离子对色谱法 离子色谱法 体积排阻色谱法 1. 键合相色谱法 （1）键合相色谱法的分类和分离机理 正相色谱：流动相极性固定相极性 分配机理 反相色谱：流动相极性固定相极性 疏溶剂（水）作用机理 拓展知识：HILIC（亲水相互作用色谱） 反相键合相色谱法的 疏水机理： 溶质进入极性流动相(水）后，其疏水基团由于水的斥力与非极性固定相上的烷基缔合，构成单分子吸附层。当流动相极性减小时，这种疏水斥力下降。 固定相的商品牌号对分离的影响 （3） 流动相 表征溶剂特性的重要参数 溶剂强度ε°：溶剂分子与吸附剂的亲合程度 溶解度参数δ：衡量溶剂极性强度的指标。是溶剂和溶质分子间色散力、偶极力、接受质子或给予质子能力的总和。δ相近的溶剂，选择性α不同。 粘度η： 溶剂的选择原则 ?具有稳定的化学性质；溶剂与检测器兼容 粘度要小；沸点不太低；纯度高且价格便宜 正相：正己烷/正庚烷为主体，加入质子受体乙醚或甲基叔丁基醚，质子给体氯仿，偶极溶剂二氯甲烷等 反相：以水为主体，加入质子受体甲醇，质子给体乙腈，偶剂溶剂四氢呋喃。 （4） 影响保留值的因素 溶质结构对保留值的影响： 正相：溶质极性越强，官能团越多，保留值越大 反相：溶质极性越弱，疏水性越强，保留值越大。溶质的保留值与其分子非极性部分的总面积有关，面积大，保留值大。 烷基键合固定相特性对保留值的影响： 反相：键合相烷链长，k大，选择性好 溶剂性质： 正相：溶剂极性越弱，保留越大 反相：流动相表面张力大、介电常数大，则极性越强。其斥力越大，溶质与固定相键合越强，保留值越大。 pH值的影响 加入酸、碱或缓冲液，控制pH，抑制溶质的离子化，改善峰形。用于分析弱酸、碱。 盐的影响： 通常加入醋酸盐、硼酸盐、磷酸盐等。抑制溶质的离子化，改善峰型，抑制拖尾，提高保留时间的重复性。 影响流动相的表面张力，所以对中性化合物的保留时间也略有影响。 应用 2 离子对色谱法 Ion-pair chromatography （1）基本原理 将一种或数种与样品离子电荷（A+）相反的离子(B-)（称为对离子或反离子）加入到色谱系统流动相中，使其与样品离子结合生成弱极性的离子对（中性缔合物）的分离方法。多为反相离子对色谱 （2）固定相、流动相和离子对试剂 固定相：多为C18,C8反相键合相 流动相：是以水为主的缓冲液，或水-甲醇、水-乙腈等混合溶剂 离子对试剂：四丁基铵正离子、十六烷基三甲基铵正离子，ClO4-，十二烷基磺酸根等 （3） 影响保留值的因素 pH的影响：改善分离选择性的有效方