分子改造强化Streptomyces hygroscopicus谷氨酰胺转胺酶催化性能研究.pdfVIP

摘 要 摘 要 谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase, EC 3, TGase)，能够催化蛋白质肽链中谷氨 酰胺残基的γ-羧酰胺基与赖氨酸 ε-酰基或其他酰基反应，形成 ε-(γ-谷氨酰基)赖氨酸共 价键。特殊的催化能力使TGase 广泛应用于食品工程、纺织与皮革加工、材料工程、生 物医药等领域。与其它来源TGase 相比，链霉菌TGase 催化活性不依赖于钙离子，且作 用底物广泛，是商品化TGase 的主要来源。然而，链霉菌TGase 存在催化活性低、热稳 定性差等缺点，严重制约了其工业应用。制备高效、稳定的TGase 一直以来是国内外研 究者关注的热点。 实验室前期筛选得到一株高产 TGase 的吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus) WSH03-13，并确定其以酶原(pro-TGase)形式分泌，在胞外被活化蛋白酶切除N 端前导 肽后转化为成熟TGase 。本论文以S. hygroscopicus pro-TGase 重组大肠杆菌表达系统为 改造平台，分别对TGase 前导肽、成熟酶N 端和C 端区域进行改造，使其催化活性和 热稳定性显著提高，并对相关机制进行分析和讨论。主要研究结果如下： (1) S. hygroscopicus TGase 前导肽功能分析 S. hydroscopicus pro-TGase 模拟结构显示，前导肽由N 端转角(turnS11-G17)和-螺旋 L 18-N30 、及C 端-螺旋R37-S42 和loopL43-P57 组成。前导肽N 端氨基酸Y 12，N27，N30 和 R32 与成熟酶之间形成7 个氢键，将上述4 个氨基酸分别置换成A ，对应pro-TGase 突 变体Y12A 仅以包涵体形式存在，而其余突变体胞外pro-TGase 分泌量也明显降低。但 缺失前导肽C 端loopL43-A52 ，pro-TGase 突变体分泌量提高70% 。而缺失-螺旋R37-S42 ， 对应TGase 分泌量无提高，但比酶活增加12.3%。将-螺旋R37-S42 分别替换成短肽AAA 或GGG，对应TGase 比酶活分别提高22.2%和24.8% ，且前导肽切割效率提高2 倍。上 述结果表明，前导肽对TGase 分泌和催化活性具有重要影响。 (2) 前导肽C 端插入短肽提高TGase 催化活性和热稳定性 将短肽GG、GGG、GGGG、GGGGS 和PTPPTTPT 分别插入至前导肽C 端切割位 点上游，即 L53 的N 端，获得一系列 pro-TGase 突变体。其中插入短肽 GGGGS 和 PTPPTTPT 对应的突变体TGase 比酶活分别提高26.1%和 35.3% 。将来源于pro-TGase 分子内部的 11 个短肽分别插入至 L53 的 N 端，其中插入短肽 SPARPGESW 和 o KTIWTHANH 对应突变体TGase 比酶活均提高40% ，且后者50℃半衰期(t1/2(50 C))提高 90% 。 (3) TGase N 端氨基酸缺失及饱和突变提高TGase 催化活性和热稳定性 缺失TGase N 端前4 个氨基酸，相应突变TGase (Del1-4) 比酶活提高32.9% ；但缺 失N 端前5 个或更多氨基酸，TGase 比酶活下降至70% 以下。在缺失TGase N 端4 个氨 基酸之后，对其第 5 个氨基酸 E62 进行饱和突变，其中突变体 Del1-4/E62D 比酶活和 o t1/2(50 C)较野生酶分别提高 90%和 1.7 倍。圆二色谱(CD)分析显示，Del1-4/E62D 二级 o o 结构并无明显变化，但其熔解温度(T )较野生酶(68.9 C)提高10.2 C 。模拟结构分析表明， m