分枝杆菌3-甾酮-Δ~1-脱氢酶在枯草芽孢杆菌中的表达及其应用研究.pdfVIP

摘 要 摘 要 甾体药物是指分子中含有甾体结构的药物，是临床上一类重要的药物。近年来随着 人们对生活质量、身体健康需求的日益提高，甾体药物体现出日益显著的价值。雄甾-4- 烯-3,17-二酮 （A ）和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮 （A ）是合成甾体类药物的重要中间 1 体，二者均可由微生物转化植物甾醇获得。3- 甾酮-△-脱氢酶 （KS ）是微生物降解 植物甾醇过程中的关键酶，它催化 A 生成 A 。本实验室前期在 自然界中选育到一 株分枝杆菌 My cobacterium neoaurum JC-12 ，它能转化植物甾醇为 A 。本研究就是在 该菌的基础上，对 KS 的性质及 A 到 A 的转化进行研究。 （1）通过 PCR 的方法，将来源于M . neoaurum JC-12 的KS 基因进行克隆，测 序，并对该酶的保守序列及跨膜结构进行预测。构建重组质粒 pET22b-ksdd ，转化大肠 杆菌 Escherichia coli BL2 1，获得重组菌 E . coli BL2 1/pET22b-ksdd 。IPTG 诱导，16℃培 养过夜，进行 S S分析。对重组菌的酶活进行测定，酶活为 0.84 U/mg 。并对重 组酶进行 Ni-NAT 纯化。以A 为底物，投量 1 g/L，重组菌进行全细胞转化，24 h 转化 率达到最大为 23.86% 。 （2 ）构建重组质粒 pMA5-ksdd ，化学转化法转化 Bacillus subtilis 168，获得重组菌 株 B. subtilis 168/pMA5-ksdd 。对重组菌株 B. subtilis 168/pMA5-ksdd 的KS 酶活进行 测定，酶活为 1.75 U/mg 。枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis 168 作为对照未检测到 KS 的酶活。对重组枯草芽孢杆菌中KS 的A 转化能力进行了分析。以A 为底物，重 组菌为催化剂，进行了全细胞转化。底物投量 1 g/L，转化 10 h ，转化率可达 65.7%，即 A 产量达 0.65g/L，约是出发菌株 A 转化率的 19 倍。摇瓶水平上，对重组菌株 B. subtilis 168/pMA5-ksdd 的发酵培养基成分、培养条件及底物助溶剂进行了优化。优化后 A 产量达 1.80 g/L，较优化前提高了 177% 。 1 关键词：3- 甾酮-△-脱氢酶；雄甾-4-烯-3,17-二酮；雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮；分枝 杆菌；枯草芽孢杆菌 缩略词：A ，雄甾-4-烯-3,17-二酮；A ，雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮； CPIP ，2,6- 1 二氯靛酚；FA ，黄素腺嘌呤二核苷酸；HPLC ，高效液相色谱；KS ，3- 甾酮-△ - 1 脱氢酶；ksdd ，3- 甾酮-△-脱氢酶基因；PMS，吩嗪硫酸甲酯；TLC ，薄层层析；NBT， 氯化硝基四氮唑蓝 I Abstract