极端嗜盐曲霉核糖体蛋白基因SpRPS3ae和SpRPL44的克隆及其抗逆功能研究.pdfVIP

中文摘要 极端嗜盐曲霉核糖体蛋白基因 SpRPS3ae 和 SpRPL44 的克隆 及其抗逆功能研究 核糖体蛋白作为构成核糖体的主要成分，生物体内高度保守。核 糖体蛋白基因除了参与细胞内蛋白质的生物合成之外，还具有 DNA 的修复功能、基因转录调控、细胞的发育调控以及细胞的分化调节等 核糖体外的功能。此外，其与肿瘤、先天性疾病有一定的关系。本实 验中材料是一株从晒盐场的周边风干野生植被表面分离和筛选得到 极端嗜盐曲霉（Aspergillus sp. ），命名为 CCHA 。作为一种具有嗜盐 性的物种，对外界环境的适应能力比较强，推测在极端嗜盐曲霉 CCHA 中存在多抗基因。 本研究中利用本实验室构建的一株极端嗜盐曲霉 CCHA 酵母表 达文库，从文库中筛选并克隆了曲霉 40s 核糖体蛋白基因 SpRPS3ae 60s SpRPL44 SpRPS3ae SpRPL44 和 核糖体蛋白基因 。 和 基因序列 ORF 分别包含 768bp 和 321bp， 分别编码256 和 107 个氨基酸，分 子量大小分别为 29.15kDa 和 12.09kDa。将 SpRPS3ae 和 SpRPL44 进 行酵母的转化，发现 SpRPS3ae 和 SpRPL44 基因能提高菌株的抗盐 能力。 为了验证 SpRPS3ae 和 SpRPL44 基因的功能，将 SpRPS3ae 和 SpRPL44 基因转入稻瘟菌，并进行逆境胁迫实验。结果发现SpRPS3ae 和 SpRPL44 能够提高转基因稻瘟菌的抗盐性，使转基因稻瘟菌对过 氧化氢的耐受力增强，敏感性降低，其在耐干旱和保护细胞膜方面也 有一定的作用。 为了进一步探究核糖体蛋白基因 RPS3ae 和 RPL44 的抗逆功 能，我们克隆获得了稻瘟菌本身的核糖体蛋白基因 MoRPS3ae 和 MoRPL44 ，并进行了酵母转化。将获得的四种转基因酵母阳性转化 子（转 SpRPS3ae 和 SpRPL44 ，转MoRPS3ae 和 MoRPL44 ），野 生型酵母菌株 (GS115) 同时进行盐胁迫实验，发现转基因的阳性酵 母转化子和野生型酵母相比具有抗盐性。同时发现，在相同盐胁迫条 件下，转极端嗜盐曲霉 SpRPS3ae 和 SpRPL44 的酵母转化子比稻瘟 菌MoRPS3ae 和 MoRPL44 的酵母转化子具有更强生活力。 为了揭示 SpRPS3ae 和 SpRPL44 基因在植物中的功能，将 SpRPS3ae 和 SpRPL44 利用叶盘转化法转染烟草，并对转基因植物 进行人工模拟的盐胁迫实验，初步验证转基因烟草植株对盐渍胁迫的 耐受性明显高于野生型的植株。通过农杆菌(ATMT)介导转化的方法 对拟南芥进行侵染转化，获 T2 代的转基因拟南芥，为下一步在拟南 芥中验证 SpRPS3ae 和 SpRPL44 基因的功能奠定了基础。 关键词： SpRPS3ae SpRPL44 极端嗜盐曲霉， 和 ，酵母表达，稻瘟菌转化， 真核表达， 抗逆功能 ABSTRACT Cloning and stress resistance analysis of ribosomal protein genes ( SpRPS3ae a