第七章 常见的色谱分离技术.ppt

色谱又称层析 1903，俄国植物学家Tsweet分离植物色素时使用。 五、色谱法的分类 按照固定相的形状分类 六、凝胶色谱 （三）凝胶过滤介质 聚丙烯酰胺凝胶 （四）、操作方法 根据所需凝胶体积，估计所需干胶量： 一般，Sephadex吸水后的凝胶体积约为其吸水量的两倍 如：Sephadex G-50 1克凝胶膨胀时吸水5克—5ml 1克凝胶膨胀吸水后的凝胶体积约10ml 3、装柱 4、平衡 （四）、操作方法 8、脱盐和浓缩 脱盐：透析法 浓缩：聚乙二醇 一次装柱后可以反复使用 ①干燥保存（较长时间不用）： 水→70％乙醇→ 90％乙醇→95％乙醇→乙醚→干燥保存 ②湿态保存（经常使用）： 水冲洗到中性，密封后高压灭菌保存。 （五）、凝胶层析的应用 1、脱盐：Sephadex G-10、G-15、G-25 2、分离提纯 3、测定大分子物质的分子量 4、高分子溶液的浓缩 六、凝胶过滤层析 七、离子交换色谱 （一）离子交换介质的性质 1、固定相（离子交换介质）的组成 ①高分子聚合物基质：树脂、葡聚糖、琼脂糖、纤维素等 ②电荷基团（功能基团） ③平衡离子 2、离子交换剂的种类 ①阳离子交换剂：平衡离子带正电，能与阳离子发生交换作用 ②阴离子交换剂：平衡离子带负电，能与阴离子发生交换作用 3、离子交换树脂的基本性质 离子交换剂的电荷基团对不同的离子有不同的结合力，一般来讲： ①、离子价数越高，结合力越大 Na+ Ca2+ Al3+ Si4+ ②、价数相同时，原子序数越高，结合力 越大 Li+ Na+ K+ Rb+ Cs+ （三）离子交换介质的种类 根据电荷基团的解离度不同，分为 弱酸型阳离子交换树脂：酚羟基或羧基 根据电荷基团的解离度不同，分为 六、凝胶过滤层析 七、离子交换色谱 （四）影响离子交换吸附和解吸的因素 （1）离子交换剂的种类 根据被分离物质在稳定pH下所带的电荷，确定是选择阳离子交换剂还是选择阴离子交换剂。 （2）、pH的影响 影响样品中组分和离子交换剂的带电性质 pH值：对弱酸和弱碱型离子交换剂影响较大 如：CM-sephadex C-25，pH＜6，则失去交换能力。 根据电荷基团的解离度不同，分为 （3）、离子强度的影响 离子强度：应在低离子强度下进行（10-50mM）。 洗脱：调节pH或提高离子强度 （四）离子交换层析的操作 2、离子交换剂的预处理：带上所需平衡离子 ①膨化：将干粉在水中充分溶胀，以使离子交换剂颗粒的孔隙增大，具有交换活性的电荷基团充分暴露出来。 ②水悬浮去除杂质和细小颗粒 ③酸碱分别浸泡：除杂，带上需要的平衡离子 ④酸处理：H型树脂 ①改变离子强度 ②改变pH 再生 8、离子交换剂的保存 洗净杂质→叠氮钠（NaN3）→4℃保存 离子交换剂的电荷基团对不同的离子有不同的结合力，一般来讲： ①、离子价数越高，结合力越大 Na+ Ca2+ Al3+ Si4+ ②、价数相同时，原子序数越高，结合力 越大 Li+ Na+ K+ Rb+ Cs+ （五）应用 1、分离纯化小分子物质 2、分离纯化生物大分子物质 3、水处理高纯水的制备、硬水软化以及污水处理 六、凝胶过滤层析 七、离子交换色谱 八、正相色谱 无修饰硅胶柱 （三）流动相的选择（非极性，如正己烷） （四）流速的选择 （五）应用 六、凝胶过滤层析 七、离子交换色谱 八、正相色谱 九、反向色谱 九、反向色谱 （三）流动相的选择 （四）色谱的主要检测器：紫外监测器 （五）应用 练习题 练习题 六、凝胶过滤层析 七、离子交换色谱 八、正相色谱 九、反向色谱 十、疏水色谱 （一）疏水色谱与反向色谱的区别 （二）原理 （三）应用 （四）疏水色谱的吸附和解吸条件 练习题 六、凝胶过滤层析 七、离子交换色谱 八、正相色谱 九、反向色谱 十、疏水色谱 练习题 1、有一蛋白质混合物，分子量相近，等电点分别为：A=9.7；B＝6.8；C＝4.5；D＝8.5；E＝7.0，在高pH 时加到 DEAE-纤维素离子交换柱上。如果用逐步降低洗脱液 pH的方法来进行洗脱，请指出各蛋白质的洗脱顺序，并说明理由。 六、凝胶过滤层析 七、离子交换色谱 八、正相色谱 九、反向色谱 十、疏水色谱 十一、亲合色谱 GST：谷胱甘肽S转移酶 （glutathione S-transferase） GSH：谷胱甘肽 底物 酶 应用：蛋白质原核表达时，在蛋白质的末端加上GST标签，构成融合蛋白。 GST-tag融合蛋白的表达 GS