细胞培养的设备与操作技术.ppt

细胞培养的设备和操作技术 主讲内容 实验室的设计和基本操作技术 培养基及其配制 细胞工程实验室它必须满足三个基本的需要，即： ?实验准备（培养基配制，洗涤与灭菌）； ?无菌操作； ?控制培养。 实验室设计 从总体上来分，实验室主要分为两类： ?基本实验室： ?辅助实验室： 1、基本实验室： ?准备室 ?接种室 ?培养室 其中：玻璃器皿包括三角瓶、试管、培养瓶、培养皿、烧杯、量筒、移液管等 移液枪（根据条件需要）由枪和枪头组成 其他：锅、微波炉等 磁力搅拌器 电子天平 pH计 △ 超净工作台： 内设紫外灯、吹风装置、过滤装置等 每次实验前要用紫外灯灭菌20分钟以上，然后喷酒精灭菌，工作过程中注意一直开着吹风机，并且一定要关掉紫外灯，过滤网应经常清洗。 其它部件： △离心机：分离原生质体用； △点融合仪：细胞融合用。 2、辅助实验室： ?细胞学实验室 ?摄影室及暗室 ?生化分析室 细胞工程实验室基本设备配制小结 ?基本设备：冰箱、天平、酸度计 ?灭菌设备：蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。 ?无菌操作设备：净化工作台、接种箱 ? 光温控制设备：时间程序控制器、空调及温度感应器。 ? 细胞培养设备：培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、摇床、生物反应器等。 ? 细胞学鉴定设备：光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜 第二部分基本操作技术 基本操作技术主要是围绕无菌操作技术展开的一系列操作技能，内容主要包括： 一．洗涤技术 二．灭菌、消毒技术 三、接种技术 一、 洗涤技术 ?、洗涤目的：去除杂物，降低带菌量 ?、根据洗涤对象的不同，主要分为： 二、灭菌、消毒技术 （三）灭菌、消毒种类 ?物理方法： ?物理灭菌：高温高压灭菌（干热/湿热）、烘烤或灼烧灭菌、射线处理、超声波等 ?物理除菌：过滤（0.1微米、0.22微米、0.45微米、0.8微米等） 、离心沉淀等； ?化学方法：使用灭菌剂，如薰蒸灭菌、消毒液灭菌（酒精、升汞、苯酚、漂白精、新洁尔灭、次氯酸钠、过氧化氢） （三）、培养基、器具的灭菌 用灭菌锅灭菌：一般121℃，灭菌20分钟。自动锅：加足水后，调好时间、温度、即可自动运转。 手动锅:加足水后，关好，通电。待压力升到0.5kg／c㎡时，打开排气阀排除锅内的冷空气。然后关闭排气阀，升至1.1kg／ c㎡(121 ℃左右)时计时，用通电、断电来保持20分钟。待降至压力为0时取出。 器具的灭菌：也可用烘箱160 ℃，90～120分钟 （五）、外植体的选择与消毒： 外植体在接种之前，须经严格的灭菌，同时又要注意不损伤外植体。不同灭菌药剂杀菌力不同，故在使用不同的药剂时，需要考虑使用浓度和处理时间，对不同植物种类的不同外植体，处理也有不同。 另外，外植体在进入消毒剂之前，应认真取材及清洗，尽可能地减少其带菌量。 附：常用消毒剂的性质 70～75％酒精： 具有较强的穿透力和杀菌力，常作为表面灭菌的第一步，它具有浸润和灭菌的双重作用，但不能彻底灭菌，必须结合其他药剂灭菌。一般处理时间为5～30s。为了提高乙醇的杀菌效果，可在乙醇溶液中加入0.1％的酸或碱，因为H+和OH-可改变细胞膜带电荷的性质而使透性增加，提高杀菌的效果 升汞（HgCl2）： 剧毒的重金属盐杀菌剂，其杀菌原理是Hg2＋与带负电荷的蛋白质结合，使菌体酶蛋白变性失活。使用浓度0.1～0.2％，一般浸泡处理6～12min就可有效地杀死附着在外植体表面的细菌及真菌，灭菌效果极好。但用升汞灭菌的外植体材料须用无菌水反复多次冲洗，才能洗去残留的汞，否则会对外植体产生毒害作用。通常用无菌水冲洗不得少于5次。由于升汞的毒性剧烈，使用中务必注意安全。 升汞废物的处理 次氯酸钠（NaClO）： 用市售的“安替福民”配制2～10％的NaClO，灭菌时间5～30min，无菌水冲洗4～5次。由于它分解出具杀菌作用的氯气，灭菌处理后易于除去，无残留，既有较强的杀菌力，又对植物无害，是常用的杀菌剂。 过氧化氢（双氧水）： 常用6～12％的溶液处理外植体材料，灭菌效果较好，由于该药剂在外植体表面容易除去，又不会损伤外植体，通常用于叶片材料的灭菌。 新洁尔灭： 一种广谱的表面活性灭菌剂，它对绝大多数植物外植体伤害很小，灭菌效果很好。通常使用1：200稀释液，处理30min或更长。 在用上述药剂进行材