一、原生质体分离.pptx

一、原生质体分离 二、原生质体分离及纯化操作 三、原生质体培养 四、体细胞杂交（原生质体融合）;（一）体细胞杂交的含义及研究历程 概念：不同亲本（种间或属间等）的原生质体，在人工诱导下，相互接触，从而发生膜融合、胞质融合、核融合并形成杂种细胞，经过培养进一步发育成杂种植株。这一过程称为原生质体融合或细胞杂交。;植物体细胞杂交的几个重要进展; （二）植物细胞融合的程序：;原生质体融合的方法;（1）电融合法：指利用改变电场诱导原生质体彼此相连成串，再施以瞬间强脉冲电压促使质膜发生可逆性电击穿，达到原生质体融合的方法。 ;双向电泳法：通过电泳，两细胞膜紧密接触，且膜表面的蛋白质分子分离，产生了无蛋白的类脂区。;;微电极法：指利用改变电场诱导原生质体彼此相连成串，再施以瞬间强脉冲电压促使质膜发生可逆性电击穿，达到原生质体融合的方法。 ;实际操作：先把待融合的细胞或原生质体混合，取样置于100V/cm的高频交流电场中，在非均匀交流电场中形成项链状排列；;再用1~5V/cm直流电脉冲/微秒冲击细胞或原生质体的粘接点，细胞膜降解造成若干微孔，于是在膜之间形成通道，使细胞质得以交换；最后导致新的球状细胞的形成。;1、原生质体在诱融剂或正弦电场作用下凝集，彼此靠近； 2、两个相邻原生质体之间的质膜相互融合，随后两个亲本原生质体质膜上的受体、糖蛋白、糖脂等成分也在融合后的质膜上重新分布； 3、细胞质发生融合； 4、细胞核发生融合，形成单核融合细胞。;（2）聚二乙醇 诱导融合法 ;PEG的选用：一般选择相对分子质量为4000获6000;PEG融合所需试剂;;;盐类融合剂种类 硝酸盐类：NaNO3、KNO3、Ca(NO3)2 氯化物类：NaCl、CaCl2 、MgCl2 、 BaCl2 葡聚糖硫酸盐类：葡聚糖硫酸钾、葡聚糖硫酸钠 盐类融合的优缺点 优点：盐类融合剂对原生质体的活力破坏力小 缺点：融合频率低，对液泡化发达的原生质体不易诱发融合;（4）高Ca2+和高pH值融合;（5）生物诱导融合法——仙台病毒法; 利用仙台病毒诱导细胞融合的步骤： （1）先将亲本细胞（待融合的细胞）分别制成悬浮液、 混合离心； （2）将沉积细胞悬于灭活的仙台病毒悬液里，在4oC低温下摇动20分钟，使细胞形成凝集块； （3）再将温度升至37oC，间歇摇动30分钟，使其融合； （4）洗去病毒，将融合细胞浮于选择性培养基进行培养。 由于4oC低温利于细胞聚集，在融合时需要提高温度，否则融合不会发生。 ;2.细胞融合的类型;3 杂种细胞的选择;互补选择：利用两个亲本具有不同遗传和生理特性，在特定培养条件下，只有发生互补作用的杂种细胞才能生长的选择方法。;A、白化互补选择法;B、营养缺陷型互补选择;C、抗性互补选择;D、温度敏感型选择;机械选择法： 利用天然存在或是人为造成的两个亲本在物理特性上的差异即可见标记，进行筛选。 利用或人为的造成细胞生长或分化能力上的差异进行筛选。 做法：在倒置显微镜下，用微管将融合细胞吸取出来进行培养的方法。;双荧光标记选择法：使用两种不同的荧光染料给双亲原生质体染上不同的颜色，然后借助不同的荧光标记，在显微镜下进行筛选。;异硫氰酸荧光素（FITC）异硫氰酸罗丹明（RITC） ;;（三） 杂种植株的再生和鉴定;杂种植株的鉴定方法：;形态学鉴定;杂种植物的核型分析;同工酶标记;染色体原位杂交;分子生物学标记;;;（四）原生质体融合的??用;番茄+马铃薯;1978年德国科学家梅歇尔斯等人把马铃薯(potato)和番茄(tomato)的原生质体融合获得了体细胞杂种“泡马豆”（pomato)杂交株同时具有马铃薯和番茄的一些形态特征，但没有产生可结实的花、果实和真正意义上的块茎，不能产生经济效益。 主要原因：生物的基因表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的，杂交株具有两个物种的遗传物质，但表达互相干扰。 ;五、原生质体的遗传饰变;细胞核移植 原生质体摄取分离的细胞核是转移和基因组的一条可行的途径。;3.叶绿体移植