第三篇 细胞生物学研究方法.docx

第三章 细胞生物学研究方法第一节 细胞形态结构的观察方法肉眼分辨率：0.2mm光学显微镜分辨率：0.2μm电子显微镜分辨率：0.2nm光学显微镜技术普通复式光学显微镜光学显微镜的组成：①光学放大系统（目镜和物镜）；②照明系统（光源、折光镜、聚光镜）；③机械和支架系统（保证光学系统的准确配置和灵活调控）缺图分辨率是指区分开两个质点间的最小距离。分辨率的高低取决于光源的波长λ，物镜镜口角α和介质折射率N。公式缺图在油镜下可提高介质折射率，从而最大分辨率达到0.2μm。光学显微镜可以直接用于观察单细胞生物体或体外培养细胞。如果要观察生物组织样品，则需要对材料进行固定，包埋，切片，染色。苏木精可以特性使DNA着色，伊红可以染蛋白质，从而能显示出细胞核细胞质的位置。相差和微分干涉显微镜光线通过样品的每一个点到达成像系统时所出现的图像是一个个模糊的圆盘，因此两个相邻的像点所显示的图像可能会发生重叠，重叠到一定程度时，就无法分辨两个点了，造成了光学显微镜的分辨极限。1、相差显微镜缺图原理：相差显微镜可以将光通过不同密度物质时产生的光程差转换成振幅差，而且相差显微镜在物镜后有一块相差板，相差板上的吸光物质增大了两组光线间的相位差，最后经透镜汇聚时便会产生相互叠加或抵消的干涉现象，从而表现出肉眼可见的明暗区别。研究对象：由于反差是以样品中的密度差别为基础形成的，故相差显微镜不需染色，可观察或细胞，甚至研究细胞器的动态。2、微分干涉显微镜原理：以平面偏振光为光源，光线经棱镜折射后分成两束，在不同时间经过样品的相邻部位，然后再经过另一棱镜汇合，从而样品中厚度上微笑的区别就会转化为明暗区别，增加反差，且具有很强的立体感。研究对象：适合于研究或细胞中较大的 细胞器，还可接上录像装置观察动态。荧光显微镜原理：主要用于检测细胞上的特异荧光染料，为此增加了两套滤光片，第一套为激发光滤片，装载光源和样品之间，只有那些能激发荧光染料发光的特定波长的光才能通过；第二套为阻断滤片，装在物镜和目镜之间，只让染料所发出的荧光通过。研究对象：是目前光镜水平对特异蛋白质等生物大分子定性定位研究的主要工具。荧光显微镜技术包括免疫荧光技术和荧光素直接标记技术。激光扫描共焦显微镜原理：激光扫描共焦显微镜可以通过在某一瞬间只用一小束光照明，该光通过检测器前的小孔或狭缝后成像，保证只有来自该叫平面的光成像，从而避免焦平面以外的荧光使观察的图像分辨率降低。优势：可通过自动改变观察焦平面形成光学切片，叠加后可重构三维结构。研究对象：研究亚细胞结构与组分的定位及动态变化。普通复式光学显微镜荧光共振能量转移技术研究对象：荧光共振能量转移技术FRET是检测活体中生物大分子纳米级距离纳米级距离变化的主要工具，可用于检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在之间的相互作用。FRET现象：当供体发射的荧光与受体发射光团分子的吸收光谱重叠，并且两个探针距离10nm范围内时，就会发生非放射性的能量转移现象。在体内两个蛋白质分子距离在10nm以内就认为有直接相互作用。原理：将供体蛋白CFP和受体蛋白YFP分别与两种目的蛋白融合表达，当两种融合蛋白间距10nm内时，CFP发出的荧光可以被YFP吸收，且激发YFP发出黄色荧光。可通过测量CFP荧光强度损失量来确定是否相互作用，距离越近损失光强度越多，检测器检测到的越少。反之，不会产生FRET效应。荧光漂白恢复技术FRAP研究对象：检测活体细胞表面或细胞内部的分子运动以及在各种结构上分子动态变化。如细胞膜的流动性验证。原理：利用高能量激光束的照射时特定区域的荧光发生不可逆的淬灭，非光漂白去的荧光标记分子在膜上或胞质中运动到光漂白区，即可是光漂白区的荧光恢复。电子显微镜技术电子显微镜的基本知识电子显微镜与光学显微镜的基本区别电镜的高分辨率主要因为使用了波长比可见光短很多的电子束作为光源，从而决定电镜要使用电磁透镜聚焦、镜筒真空、荧光屏或感光胶片记录图像。电子显微镜的分辨本领和有效放大倍数电镜的分辨本领是指电镜处于最佳状态下的分辨率。由于生物制样技术限制的分辨率远低于分辨本领电子显微镜的基本构造：①电子束照明系统：电子枪、聚光镜；②成像系统：包括物镜、中间镜与投影镜，通过电磁在变化磁场中的运动聚焦成像；③真空系统：高真空以利于电子运动；④记录系统：用荧光屏或感光胶片记录。主要电镜制样技术介绍超薄切片技术由于电子束的穿透能力有限，为获得高分辨率，切片厚度一般仅为40-50nm，称超薄切片。步骤：固定：为保证样品的形态结构不发生改变，需要用固定剂进行固定，常用固定剂为锇酸和戊二醛，或物理方法如高频微波。固定操作过程中，取材要快速进行，通常在低温下固定，以防止酶的自溶造成超微结构的破坏；包埋：包埋的目的是要使样品中各种细微结构在切片过程中都得到均匀良好的支持，且有足够的强度，耐