第三篇 分子克隆工具酶-13级.ppt

反转录酶(reverse transcriptase) 即依赖于RNA的DNA聚合酶，有5→3合成DNA活性，但是无 3→5外切核酸酶活性。 禽成髓细胞瘤病毒（AMV） 包含两条多肽链，具 5→3DNA聚合酶活性和很强的RNaseH活性，在42℃能有效发挥作用。 Moloney鼠白血病病毒（M-MuLV） 单链多肽，其RNaseH活性弱，有利于合成较长的cDNA 用途：以mRNA为模板合成cDNA ；5′突出DNA的补平和标记；DNA测序等。 末端转移酶(terminal transferase) 来源于小牛胸腺，是一种不依赖于模板的DNA聚合酶。 在Co2+/Mg2+存在下，末端转移酶催化dNTP加于DNA分子的3-OH端。 作用 标记DNA的3′末端 在cDNA或载体3末端加同聚尾，便于克隆。 第四节 其他分子克隆工具酶 一、依赖于DNA的RNA聚合酶 二、连接酶 三、T4多核苷酸激酶 四、碱性磷酸酶 五、核酸酶 一、依赖于DNA的RNA聚合酶 活性 即转录中的RNA合成酶，识别DNA中各自特异的启动子序列，并沿此DNA模板起始RNA的合成。 聚合反应时，无需引物，但需识别特异性位点。 类型 SP6噬菌体RNA聚合酶 (来源于感染鼠伤寒沙门氏菌LT2菌株) T4噬菌体RNA聚合酶 T7噬菌体RNA聚合酶 (来源于噬菌体感染的大肠杆菌) 应用：体外合成RNA分子、表达外源基因。 二、连接酶(ligase) 连接酶就是将两段核酸连接起来的酶，相当于基因工程中的“糨糊”。 连接酶的种类 T4 DNA连接酶 (16℃反应) 活性：催化DNA 5′-P与3′-OH之间形成磷酸二酯键。 反应底物：黏端、切口、平末端的RNA(效率低)或DNA连接 大肠杆菌DNA连接酶：平末端连接效率低。 Taq DNA连接酶 (45~65℃反应) 连接双链DNA中的缺口，不能代替T4 DNA连接酶。 T4 RNA连接酶 黏性末端DNA片段的连接 三、T4 多核苷酸激酶 T4多核苷酸激酶是一种磷酸化酶，可将ATP的γ-磷酸基团转移到DNA或RNA的5′末端。 分子克隆中呈现2种反应 将ATP的γ-磷酸基团转移到无磷酸的DNA5′末端 在过量ATP存在的情况下，可将DNA的5′-P转移给ADP，然后DNA从ATP中获得γ-磷酸而重新磷酸化。 应用 对缺乏5′-P的DNA进行磷酸化 对DNA末端进行放射性标记（[γ-32P]-ATP）。 四、碱性磷酸酶 碱性磷酸酶是一类能催化除去DNA或RNA分子的5 磷酸，使末端转换成5 -OH的酶。 类型 牛小肠碱性磷酸酶（CIAP） 细菌碱性磷酸酶 (BAP) 虾碱性磷酸酶 (SAP) 用途 去除5-P，防止DNA片段自身连接 标记(5端)前去除DNA或RNA的5-P 如何解决质粒自身连接？ 五、核酸酶 BAL31核酸酶 具有3外切核酸酶活性，可从线性DNA两条链的3端迅速去除单核苷酸。 用途 从两头缩短DNA，用于构建嵌套缺失体；制作DNA限制酶切图。 S1核酸酶 一种单链核酸酶，降解单链DNA或RNA，产生带 5-P的单核苷酸或寡核苷酸双链。 用途 DNA黏性末端变为平末端，打开双链cDNA合成中产生的发夹环。 核糖核酸酶A (RNase A) 内切核酸酶，特异攻击RNA上嘧啶残基的3′端。 用途 去除DNA样品中的RNA 核糖核酸酶H (RNaseH) 内切核酸酶，特异性水解与DNA杂交的RNA上的磷酸二酯键，产生带有3′-OH和5′-P末端的产物，不降解单链核酸、dsDNA或dsRNA. 用途 在cDNA克隆合成第二链之前去除RNA 脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ) 来源于牛胰，为内切核酸酶，可优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链DNA. 用途 去除RNA样品中的DNA 切口平移标记时在dsDNA上产生随机切口 外切核酸酶Ⅲ (exonucleaseⅢ) 催化从dsDNA 3′-OH端逐一去除单核苷酸的反应。底物为线状dsDNA和带切口或缺口的环状DNA. 用途 制备部分截短的DNA，用作探针 制备单向缺失的DNA等。 本章涉及基因工程操作中大多数工具酶的特性及其用途，知识点多，内容分散，涉及面广，需要花多点时间复习才能掌握！ 本章复习要点 1、限制性内切酶：分类、命名原则、识别序列、黏性末端、平末端、同裂酶、同尾酶、稀切酶、酶切反应条件、星星活性等 2、DNA聚合酶：各种酶的活性特点、切口平移法标记DNA的原理、各种酶的用途等 3、RNA聚合酶的活性与用途 4、连接酶的类型与用途 5、T4多核苷酸激酶与碱性磷酸酶区别与用途 6、几种核酸酶特点及用途 第三章 分子克隆工具酶 第一节 限制性内切酶 第二节 甲基化酶 第三节 DNA聚合酶 第四节