大肠杆菌外膜蛋白酶基因OmpT的克隆及表达.pdf

中国农业科技导报，2011，13(2)：53—58 JournalofAgricultural ScienceandTechnology 大肠杆菌外膜蛋 白酶基因OmpT的克隆及表达 董世雷 ， 刘 伟 ， 朱立颖 ， 王学琴 ， 于宏伟 ， 王 欣 (1．浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江 金华 321004；2．浙江省农业科学院植物保护与 微生物研究所 ，杭州 310021；3．内蒙古工业大学化工学院，呼和浩特010051； 4．马歇尔大学微生物学与免疫学院，亨廷顿 25755，美国) 摘 要 ：OmpT(Outer—membraneproteasesT)是革兰氏阴性细菌分泌到细胞表面具有丝氨酸蛋白酶活性的一种 重要蛋白。利用大肠杆菌OmpT降解抗菌肽特性来筛选和改造新型抗菌肽，可以为开发抗OmpT蛋 白酶水解 新抗菌肽序列提供新的思路和创造条件。根据大肠杆菌外膜蛋白酶OmpT的基因序列设计一对引物，应用聚 合酶链式反应(PCR)方法，从大肠杆菌K12基因组中扩增获得一段为954bp的序列，测序结果显示此序列与 已公布序列同源性达99．99％。将其序列定向克隆到原核表达载体 pET28a上构建重组表达质粒pET28a— OmpT。经 IPTG诱导后，在表达宿主菌中特异性的表达出分子量约为36kDa且具有生物活性的OmpT蛋 白。 生长曲线试验显示，抗菌肽LL37对带重组表达质粒 pET28a—OmpT的大肠杆菌生长没有影响，而对照组的生 长明显受到抗菌肽的抑制作用。 关键词：OmpT；克隆与表达汐 膜蛋白酶 ；抗菌肽 doi：10．3969／j．issn．1008-0864．2011．02．08 中图分类号：Q786 文献标识码 ：A 文章编号：1008-0864(2011)02-0053-06 CloningandExpression ofEscherichiacoliOuter M embraneProteasesGeneOmpT DONG Shi—lei’，LIU Wei，ZHU Li—ying ，WANG Xue—qin ， YU Hong．wei．WANG Xin (1．CollegeofChemist~andlifeScienceofZh~iangNormalUniveristy，Zh~iangJinhua321004； 2．InstituteofPlantProtectionandMicrobiology，ZhejiangAcademyofAgnculturalSciences，Hangzhou310021； 3．ChemicalEngineeringCollege，InnerMongoliaTechnologyUniversity，Hohhot010051，China； 4．SchoolofMicrobioloyg andImmunoloyg，MarshallUniversity，Huntington25755，USA) Abstract：TheoutermembraneproteasesT (OmpT)ofEscherichiacoliisasurfacemembraneproteinwithserine proteaseactivity．When OmpT could dergade antimicrobialpeptide．itwasused to screen and reconstructnovel antimicrobialpeptide，whichprovidednew ideafordevelopingantimicrobialpeptidesofOmpT．Inthispaper，apair ofprimerswasdesignedaccordingtoOmpTsequenceofE．coli，anda954bpsequencewasobtainedbyPCR from E co