胚胎干细胞培养SOP.docVIP

胚胎干细胞培养标准化操作规程(SOP)一、细胞 多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡 1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。由Dr. Nagy的实验室制备。　　2．D3-ATCC; CRL-1934. 我们得到时大约传了17代。　　3．J1-由Dr. Jaenish的实验室友情提供。我们得到时大约传了7－9代。　　4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由Dr. Jaenish的实验室友情提供。　　5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由Dr. Nagy的实验室提供。 二、一般培养——维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到 80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37，5％CO2，100％湿度条件下培养。 培养基 ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20。通过将21ml该溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4。 注：一瓶DMEM是500ml。 贮存液 DMEM(高糖) 　　马血清（HS） 　　L-谷氨酰胺（200mM） 　　MEM NEAA（10mM） 　　HEPES（1M） 　　β-巯基乙醇（55Mm） 　　PEST 　　ESGRO 复苏细胞 细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。 步骤 1．从液氮中取出一管细胞；　　2．将冻存管置于37水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；　　3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；　　4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；　　5．离心3分钟；　　6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；　　7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；　　8．孵育。 冻存细胞 冻存液：90％HS和10％二甲基亚砜 步骤： 1．1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内；　　2．用细胞刮刀收集细胞；　　3．将细胞转入15ml Falcon管内并离心3分钟；　　4．弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中（10cm的培养皿用2ml，15cm的培养皿用6～7ml。）　　5．分装于冻存管内，每管1ml；　　6．置－80过夜，第二天移入液氮。 明胶包被 准备500ml 0.1％明胶溶液　　1．将0.5g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中（50－65水浴15～30分钟）。　　2．最好在溶液没有冷却的情况下通过0.2μm滤膜过滤，贮存在4。 包被培养板或培养皿 1．加入足量的明胶溶液覆盖培养平面（15cm培养皿加2ml，10cm培养皿加0.5～1ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆盖培养表面就行了）；　　2．置室温30分钟；　　3．去除明胶溶液，将培养板贮存在包装袋中室温放置，最好将板子平方，以免明胶污染盖子和流出培养板。 细胞传代 建议每2－3天传代细胞一次，过度生长的细胞会降低细胞的自然分化率，我们建立了一种纯化方法来去除分化细胞，在将细胞接种在明胶包被的培养板上之前，通过将分化细胞黏附在没有包被的组织培养板上去除分化细胞。纯化步骤包含在下面的方法中。 1．去除培养液；　　2．1×无钙镁PBS洗涤；　　3．加入1×胰酶EDTA(10×胰酶EDTA用PBS稀释。)37孵育5分钟。　　4．加入ES培养基使胰酶失活；　　5．将细胞转入15ml离心管中离心3min；　　6．去除上清，将细胞重悬于2mlES培养基，至少吹打10－20次。　　如果加入培养基的量较少会比较容易将细胞团弄散分开。ES细胞有聚集成团的倾向，传代过程中仔细将细胞弄散分开很重要。这样可能会减少细胞的自然分化。　　7．将细胞接种在没有包被的组织培养皿中（使用和一开始同样规格的培养皿）放入温箱2小时（分化细胞在该时间内将黏附，而ES细胞仍将保持悬浮）；　　8．将含有细胞的培养基转入明胶包被（见下文）的组织培养皿。吹打以确保细胞被分散开（前面已经提到--ES细胞有聚集成团的倾向）　　9．建议按1：4－1：10的比率传代(ATCC) 保持细胞的传代比率很重要，以我们的经验，1：8的比率是好的，可以使细胞的自然分化降到最低。当你使用不同规格的培养板进行