程文则-神经组织摘要.ppt

CNS损伤后的变化 1.神经元存活，近端出芽再生 2.神经元死亡，附近未损伤者侧枝出芽 3.轴突侧枝损伤，未损伤侧枝出芽 CNS损伤后的变化 脊髓损伤的移植治疗方法 神经因子结合桥接体移植 自体周围神经移植 中枢神经组织移植 采用带血管蒂的自体周围神经与胚胎中枢神经组织神经干细胞联合移植 神经干细胞移植 运用基因工程手段大量扩增骨髓间质细胞 治疗同一个患者 骨骼及相关疾病 中枢神经系统疾病 局部麻醉，抽取骨髓 人体骨髓的获取-骨髓穿刺术 骨髓间充质细胞 Mesenchymal Stem Cells Easy isolation, high expansion, reproducible 骨髓间充质干细胞的培养纯化 取Wistar大鼠1只麻醉 无菌条件下取大鼠双下肢，剪除软组织，留取股骨和胫骨 将骨骺端剪去，暴露两端骨髓腔 DMEM/F12培养液反复冲洗骨髓腔 冲洗液收集于无菌离心管中，离心，弃上清，加入体积分数0.10血清培养液，充分吹打至单细胞悬液 调细胞浓度为4×108/L,接种于培养瓶中 置于37 ℃、体积分数0.05 CO2培养箱中培养 48 h后全量换液，去除未贴壁细胞 以后每3~4 d换液一次，待细胞长至80％~90％融合后，用含0.2 g/L EDTA及0.25 g/L胰酶的消化液消化，以细胞密度4×108/L接种传代 BMSCs的分化 BMSCs的体外诱导分化方法 抗氧化剂作诱导剂，如： 2- 琉基乙醇 2%二甲基亚枫 硫代甘油 生长因子作诱导剂，如： 血小板衍生生长因子 PDGF 表皮生长因子 EGF 肝细胞生长因子 PGF 胰导素样生长因子 IGFs BMSCs的鉴定 BMSC以0.25%胰蛋白酶 /1m MEDTA消化10分钟 1 离心 (10gX10分钟)，pBS洗2次 2 离心后以PBS重悬 3 细胞孵育在PE结合的抗大鼠CD90单抗和FITC结合的抗大鼠CD45单抗中30min 4 孵育后PBS洗2次，然后进行流式细胞分析 5 采用流式细胞方法检测培养细胞表面的骨髓基质细胞标志CD90和造血细胞标志CD45。 MSCs的鉴定 MSCs的表型不均一，分别具有间充质细胞、上皮细胞和内皮细胞的特点 MSCs阳性表达的抗原:SB-10、SH-2、SH-3、SH-4、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a和CD124等 MSCs阴性表达的抗原:CD1a、CD11b/c、CD31、CD34、CD14、CD45、CD56、ESA等 免疫磁珠法分选细胞 操作过程 超级顺磁性的 MACS （微型磁珠）标记细胞 把这些细胞通过高梯度磁场中的分选柱；标记细胞滞留在柱里而未标记细胞则流出 将分选柱移出磁场，洗脱滞留柱内的细胞 原理 已包被一抗的磁珠与细胞表面相应分子特异性结合，或者已包被二抗(羊抗小鼠或羊抗大鼠)的磁珠与预先已与细胞表面分子特异结合的一抗结合 BMSCs的免疫磁珠法 Stro-1+是用CD34阳性骨髓细胞进行免疫产生的IgM单抗，能识别一种人骨髓基质成分表达的表面抗原 Stro-1+是骨髓基质干细胞的表面标志，可作为一种有价值的抗体，与免疫磁珠分离技术相结合用来鉴定、分离和功能检测人骨髓基质干细胞。 雪旺细胞 圆筒状、展开似梯形扁平，，核椭圆，胞质少 形态： 保护、绝缘、形成髓鞘 功能： 雪旺细胞修复神经损伤 合成结构性细胞外基质，包绕有髓纤维形 成髓鞘和基底膜 分泌合成多种促神经生长物质 吞噬髓鞘碎屑，为神经再生通畅道路 增殖迁移形成Büngner带， 支持引导再生锥生长 A B C D 释放生物活性因子，表达多种细胞粘附分子和 受体 导向作用，充当神经轴突的导管 E F 雪旺细胞的分离纯化 脱颈法处死仔鼠，75％酒精消毒，D—hanks液冲洗。 切开股骨干后外侧皮肤，取双侧坐骨神经，置于D—hanks’液中 剥除神经外膜，分离得到神经束。D—hanks液漂洗3次。剪成碎块 用吸管将其移至离心管中。加入0．25％的胰蛋白酶和1 ml 0．2％的I型胶原酶37℃混合消化。 吸弃上清液，再加入0．2％的I型胶原酶4 ml，37％消化，消化过程中每隔20 min振荡消化液一次以利于消化。 消化结束后，利用玻璃吸管进行机械吹打，直至溶液呈混悬状，无明显肉眼可见组织 1 000 r/min离心5 min，吸弃上清并加入DF12培养液4ml(含体积分数为20％胎牛血清) 终止消化，再次1 000 r／min离心5min，吸弃上清，加入DFl2培养液4 ml(含体积分数为20％的胎牛血清)吹打混匀 计数后将细胞悬液接种于塑料细胞培养瓶，置体积分数为5％的CO2孵箱中3